彭麗媛 王海瀾（等）

[摘要] 目的 觀察實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠肺臟微血管通透性的變化，為臨床提供糖尿病肺病的形態(tài)學(xué)依據(jù)。 方法 雄性SD大鼠共60只，體重（220±20）g，按65 mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲菌素（STZ）來(lái)制備糖尿病大鼠模型，在成模即刻（0周）、成模后2、4、8、12周時(shí)分別隨機(jī)抽取12只，通過(guò)干濕重法、尾靜脈注入伊文思藍(lán)（EB）并心臟灌注后在分光光度計(jì)下測(cè)肺組織OD值以及熒光顯微鏡下測(cè)其熒光量來(lái)了解肺臟微血管的通透性。另隨機(jī)抽取12只大鼠作為正常組。 結(jié)果 ①與正常組比較，0周組、2周組糖尿病大鼠肺組織的干濕重稍有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。而4周組、8周組和12周組糖尿病大鼠出現(xiàn)了組織干濕重明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。②與正常組相比較，0周組、2周組糖尿病大鼠肺組織EB含量稍有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。從4周開(kāi)始，糖尿病大鼠出現(xiàn)肺組織EB含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。③熒光顯微鏡下觀察肺腑組織熒光量可見(jiàn)4、8、12周組大鼠肺臟組織出現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光。 結(jié)論 糖尿病導(dǎo)致大鼠肺臟微血管通透性發(fā)生了變化。

[關(guān)鍵詞] 糖尿??；糖尿病肺??；微循環(huán)障礙；伊文思藍(lán)；通透性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（c）-0023-04

Changes in microvascular permeability of lung in experimental diabetic rats and its significance

PENG Liyuan1 WANG Hailan1 ZHAI Fanglong1 XIE Zaiming1 WANG Mingjun2

1.Affiliated Shenzhen Longgang Central Hospital of Zunyi Medical College， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China； 2.Shenzhen Children's Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518000， China.

[Abstract] Objective To observe the changes of microvascular permeability of lung in experimental diabetic rats， and to offer clinical morphologic data for diabetic pulmonary disease. Methods 60 male SD rats with （220 ±20） g were selected and injected with Streptozotocin （STZ） intraperitoneally at a dose of 65 mg/kg body weight to make experimental DM rat models. Then respectively， 12 of them were randomly selected at 0， 2， 4， 8， 12 weeks to measure their dry weight and wet weight of lung tissues. Also， the OD values were observed through spectrophotometer and the amount of fluorescence by a fluorescence microscope after the rats were injected Evans blue （EB） into tail vein. Another 12 rats were randomly selected as normal group. Results ①The difference of lung tissue wet-dry weight among normal group and 0 week group， 2 weeks group was not statistically significant （P > 0.05）. The lung tissue wet-dry weight in 4 weeks group， 8 weeks group， 12 weeks group were all higher than those in normal group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ②The difference of lung tissue EB content among normal group and 0 week group， 2 weeks group was not statistically significant （P > 0.05）. The lung tissue EB content in 4 weeks group， 8 weeks group， 12 weeks group were all higher than those in normal group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ③And expression strong red fluorescence was found in the lung tissue of 4 weeks， 8 weeks， 12 weeks group through the fluorescence microscopy. Conclusion Diabetes leads to the changes of lung microvascular permeability in rats.

[Key words] Diabetes； Diabetic pulmonary disease； Microcirculatory disturbance ； Evans blue； Permeability

糖尿病的患病率日益增加，它可使心血管、腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等全身多個(gè)組織器官的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，由于它的致殘、致死性并發(fā)癥，目前已成為全球最關(guān)注的健康問(wèn)題之一。20世紀(jì)70年代，Yeh等[1]首次提出肺臟可能是糖尿病的靶器官之一。糖尿病引起肺臟損害的假設(shè)在之后的國(guó)內(nèi)外研究中得到了肯定[2-3]，并且也越來(lái)越受到人們的重視。然而到目前為止，糖尿病引起肺功能損害的原因仍未完全明確。糖尿病對(duì)心血管、腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等組織器官損害的基礎(chǔ)病變是糖尿病微血管病變，而肺組織存在著豐富的結(jié)締組織和血管系統(tǒng)，因此肺部微血管改變亦是糖尿病肺臟損害的病理基礎(chǔ)，故而設(shè)計(jì)了本課題，旨在為臨床提供糖尿病肺病的形態(tài)學(xué)依據(jù)，也為臨床上預(yù)防和治療糖尿病肺病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用健康雄性SD大鼠，體重200～240 g，平均（220±20）g，共72只，購(gòu)于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物房采用晝夜交替，時(shí)間為12 h/12 h，保證室內(nèi)溫度（22±2）℃，嚴(yán)格遵照遵義醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室管理制度要求。

1.2 藥品與儀器

鏈脲菌素（STZ）：美國(guó)Sigma公司，cas 18883-66-4，由上海寶曼生物公司提供；多聚甲醛、伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）、甲酰胺均由上海寶曼生物公司提供。血糖儀及試紙、電子天平、平頭針、頭皮針、輸液架、自動(dòng)脫水機(jī)、自動(dòng)包埋機(jī)、離心機(jī)、石蠟切片機(jī)、恒溫水浴箱、烤箱、722分光光度計(jì)、熒光顯微鏡、大鼠固定器。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的制備

健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，以65 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔一次性注入新鮮配制的STZ溶液來(lái)制備糖尿病模型。72 h后，采取尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖>16.7 mmol/L則入選為糖尿病模型。正常組的大鼠則腹腔內(nèi)注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。成模后大鼠給予自由飲食，不用任何藥物干預(yù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

SD大鼠中隨機(jī)選取12只作為正常組，腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；為防止大鼠造模失敗及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡而造成的數(shù)據(jù)缺失，實(shí)驗(yàn)組大鼠的實(shí)際數(shù)量為67只，將它們?nèi)吭炷：筇蕹炷２怀晒Φ拇笫螅炷３晒Φ拇笫髣t繼續(xù)飼養(yǎng)，在0、2、4、8、12周時(shí)間點(diǎn)，分別隨機(jī)選取12只作為該組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為兩個(gè)區(qū)組，區(qū)組1的大鼠行心臟灌注，取下肺組織稱(chēng)其干濕重；區(qū)組2大鼠則尾靜脈注入伊文思藍(lán)，循環(huán)1 h后行心臟灌注，再在分光光度計(jì)下測(cè)肺組織的OD值、制作石蠟切片后在熒光顯微鏡下觀察其熒光量。

1.3.3 干濕重法測(cè)肺臟組織的含水量

麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，心臟灌注生理鹽水直至右心房流出液呈無(wú)色、肺臟變白、肝臟和腎臟變裸色、可視血管均呈白色為止，再灌注室溫4%多聚甲醛60 mL，直至大鼠身體變硬為止。取下肺組織，稱(chēng)其濕重。再置于58℃烘箱中烘烤72 h至恒重，稱(chēng)其干重。按Elliot公式計(jì)算每毫克肺組織的含水量：肺組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%，用組織含水量的差異來(lái)表示肺微血管通透性的變化。

1.3.4 伊文思藍(lán)灌注法測(cè)肺組織微血管的通透性

1.3.4.1 肺組織EB含量的測(cè)定

1.3.4.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取1mg EB置于EP管中，加甲酰胺至10 mL，混勻后從中取出0.8 mL置于EP管中，再加甲酰胺至10 mL，此作為第1管，此時(shí)其濃度為8 μg/mL；從第1管中取5 mL，加入甲酰胺至10 mL，作為第2管，其濃度為4 μg/mL；再?gòu)牡?管中取5 mL加入甲酰胺至10 mL，作為第3管，濃度為2 μg/mL……照此類(lèi)推，共9管。將各管液體置于50℃水浴箱48 h后，以甲酰胺作為空白對(duì)照溶液，用722 N可見(jiàn)分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定各管溶液的吸光度（即OD值），從而計(jì)算出回歸方程：Y=22.938X-0.1066，（R2 = 0.999）。見(jiàn)圖1。

圖1 EB標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4.1.2 EB含量的測(cè)量 參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[4]，大鼠經(jīng)尾靜脈以1.5 mL/kg的濃度注入3%EB溶液，循環(huán)1 h后，麻醉、心臟灌注，取下左肺組織，稱(chēng)重，置入3 mL甲酰胺溶液中，在50℃恒溫水浴箱中孵育48 h以使肺組織中的伊文思藍(lán)充分溶解在甲酰胺中，再以4000 r/min的速度離心20 min。取上清液，722分光光度計(jì)下測(cè)肺組織的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出每份肺組織的EB濃度。再將它與質(zhì)量相比，可得每克肺組織的EB量，即：每克肺組織EB量（μg/g）=EB濃度（μg/mL）×3 mL/重量（g）。

1.3.4.2 石蠟熒光

如前所述，參照文獻(xiàn)方法[5]，尾靜脈注入EB循環(huán)1 h后，麻醉大鼠，行心臟灌注，取下右肺組織后置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，自動(dòng)脫水機(jī)脫水并自動(dòng)包埋機(jī)包埋后再制成石蠟病理切片（防脫玻片），烤片2.5 h，置梯度酒精脫蠟、水化，直接甘油封片，立即在熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下觀察EB在肺組織中的分布。相同曝光條件下，拍照記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型制備的結(jié)果