張玉麗，郭 芹，彭新媛，王吉德，吳忠紅，潘 儼，吳 斌，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊830091；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100094；3.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

果實(shí)的形成是果實(shí)生命的開(kāi)始，歷經(jīng)生長(zhǎng)和發(fā)育直至成熟，伴隨著成熟而來(lái)是衰老及軟化[1]。軟化是果實(shí)成熟的一個(gè)重要標(biāo)志，除了使果實(shí)的外觀品質(zhì)發(fā)生變化外，還削弱了果實(shí)抵抗周?chē)涣家蛩氐哪芰?，致使果?shí)的耐藏性和抗病性下降，縮短貯藏期及貨架期。通常認(rèn)為，果實(shí)的軟化是由于細(xì)胞中膠層（果膠物質(zhì)）結(jié)構(gòu)的改變，引起細(xì)胞分離和細(xì)胞壁物質(zhì)降解所造成的細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)的破壞[2-4]。果實(shí)的軟化與細(xì)胞壁降解酶的活性密切相關(guān)，尤其是多聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶，同時(shí)也受果膠甲酯酶、果膠裂解酶和β-半乳糖苷酶等細(xì)胞壁降解酶活性的影響[5-7]。

果實(shí)軟化問(wèn)題一直以來(lái)倍受生理學(xué)家及園藝學(xué)家的關(guān)注[8-9]。因此，研究與果實(shí)軟化相關(guān)的細(xì)胞壁降解酶，將有利于找出影響果實(shí)軟化的關(guān)鍵因子，為果實(shí)軟化調(diào)控、延長(zhǎng)貯藏期提供理論依據(jù)。

前期工作表明本實(shí)驗(yàn)室自制雙組份SO2-ClO2保鮮劑先后釋放出SO2和ClO2兩種保鮮氣體，其可有效保持紅提葡萄的貯藏保鮮效果，延長(zhǎng)葡萄的貨架期。本文將進(jìn)一步研究雙組份SO2-ClO2保鮮劑對(duì)紅提葡萄采后軟化酶的影響，以期從果實(shí)生理學(xué)的角度探究雙組份SO2-ClO2延緩果實(shí)衰老和軟化的機(jī)理，為雙組份SO2-ClO2在采后貯藏中的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)符合綠色食品規(guī)范的葡萄保鮮貯運(yùn)技術(shù)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙組份SO2-ClO2保鮮劑 采用亞硫酸鹽釋放出SO2氣體還原氯酸鹽產(chǎn)生ClO2氣體的發(fā)生方法制備雙組份保鮮劑。將焦亞硫酸鹽、亞硫酸鹽、次氯酸鈉、氯化鈉分別研細(xì)至100目備用，按SO2發(fā)生劑（A）與ClO2發(fā)生劑（B）質(zhì)量比例為10/1，加入和豐膨潤(rùn)土、硅藻土及無(wú)機(jī)鹽添加劑，混合至均勻，采用熱壓膠合制備成葡萄保鮮紙；N-三（羥甲基）甲基甘氨酸（Tricine）、半胱氨酰（cysteine）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、乙二胺四乙酸（EDTA）、果膠、氫氧化鈉、氯化鈉、百里香溴酚藍(lán)、醋酸鈉、冰醋酸、多聚半乳糖醛酸（PGA）、β-巰基乙醇、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、D-（+）半乳糖醛酸、咔唑、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、羥甲基纖維素鈉（CMC）、碳酸鈉等 均為分析純。

UV2600型紫外分光光度計(jì)日本島津儀器有限公司；DK-8D型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；Himac CR-20B2大型臺(tái)式冷凍離心機(jī)日本日立公司；IKA MS3 basic旋渦混合器 浙江納德科技有限公司；FW-80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 葡萄樣品的處理

紅提葡萄 采自新疆昌吉三平農(nóng)場(chǎng)，采收時(shí)選取大小和成熟度一致、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的果實(shí)，采摘后每筐按照發(fā)泡網(wǎng)，吸潮紙，供試葡萄7kg的順序進(jìn)行裝框?？騼?nèi)待供試品采摘當(dāng)天入庫(kù)，敞口預(yù)冷24h后，分別加入吸潮紙和保鮮紙（對(duì)照樣品只加吸潮紙，處理試樣分別加雙組份SO2-ClO2和單組份SO2，每種處理各設(shè)置6個(gè)平行筐），再放入厚度為0.03mm葡萄保鮮專(zhuān)用袋，扎口繩密封后置于（0±1）℃，RH 80%的條件下貯藏。每隔10d定期取樣，取樣時(shí)將果皮和果肉剝離，迅速用液氮冷凍，置于-80℃的超低溫冰箱中備用。

1.3 果膠含量的測(cè)定

1.3.1 試劑配制 取無(wú)水乙醇1000m L，加4g鋅粉及4m L濃硫酸溶液（1+1），恒溫水浴回流10h，餾出液加鋅粉和KOH（以每1000m L各加4g），重復(fù)蒸餾1次；取純咔唑0.15g，用上述精制乙醇溶解并定容至100m L；取100mg半乳糖醛酸，溶解后定容至100m L，并以此為母液分別配制濃度為10～70μg/m L的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考張小玲的方法[10]，分別取具塞試管8支，依次加入濃硫酸12m L，置于冰水中依次緩慢加入0～70μg/m L的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2m L，充分混勻。于沸水浴中加熱10min，迅速用流動(dòng)水冷卻至室溫，各管再依次加入咔唑乙醇溶液1m L，混合均勻后室溫放置30m in充分反應(yīng)。以0號(hào)管為對(duì)照，于530nm下測(cè)定吸光度值。以半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品測(cè)定

1.3.3.1 樣品前處理 參考游新俠等[11]方法，將樣品研碎過(guò)60目篩，分別取5～10g于燒杯中，加入70%的熱乙醇，充分?jǐn)嚢枰蕴崛∑渲械奶穷?lèi)，過(guò)濾，反復(fù)操作直至濾液不呈糖類(lèi)反應(yīng)（苯酚-硫酸法檢測(cè)）。殘?jiān)来斡?9%乙醇和乙醚洗滌，之后風(fēng)干乙醚。

1.3.3.2 果膠提取 a.水溶性果膠提?。河?50m L水將上述漏斗中殘?jiān)迫?50m L燒杯中，加熱至沸并持續(xù)沸騰1h，隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，冷卻后移入250m L容量瓶中，加水定容，搖勻后過(guò)濾（布式漏斗抽濾，棄去初濾液），收集濾液即為水溶性果膠提取液。b.總果膠提?。河?50m L HCl（0.05mol/L，加熱至沸）將漏斗中的殘?jiān)D(zhuǎn)入燒瓶中，于沸水中加熱回流1h，冷卻后轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加2～3滴甲基紅指示劑，用0.5mol/L NaOH滴定中和后，用水定容至250m L容量瓶中，搖勻后過(guò)濾，濾液即為總果膠的提取。

1.3.3.3 測(cè)定 取適當(dāng)濃度的果膠提取液2m L（提取液用水稀釋?zhuān)肴樘侨┧?0～70μg/m L），按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法操作，根據(jù)吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算半乳糖醛酸濃度（μg/m L）。

1.3.3.4 樣品中果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算

式中，X—樣品中果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以半乳糖醛酸計(jì)），%；V—果膠提取液的總體積，m L；K—提取液的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)K=10；C—標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的半乳糖醛酸濃度，μg/m L；m—樣品質(zhì)量，g。

1.4 果膠甲酯酶（PME）活性的測(cè)定

參照Pathak等的方法[12]。將冷凍葡萄樣品研磨成粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g，加入4m L預(yù)冷的0.05mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 7.0，內(nèi)含6.8%NaCl、1.8mmol/L EDTA），充分浸提20～30m in，12000r/m in 4℃下離心20m in，上清液用于酶活性的測(cè)定。反應(yīng)體系中依次加入2m L 0.01%的果膠溶液（pH 7.5，用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)），0.4m L NaCl（0.15mol/L），0.2m L 0.01%的百里香溴酚藍(lán)指示劑，0.4m L的雙蒸水和0.2m L的酶液，混勻后迅速比色，于620nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值的變化，OD620每分鐘變化0.001為一個(gè)酶活力單位（U），酶活性以U·g-1·FW表示，每個(gè)處理平行測(cè)定3次。

1.5 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的測(cè)定

參照Barreit等[13]的方法。將冷凍葡萄樣品研磨成粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g，加入4m L預(yù)冷的0.1mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.5，內(nèi)含1mmol/L EDTA，0.7m L 10mmol/L β-巰基乙醇），充分浸提20～30min，12000r/m in 4℃下離心20min，取上清液為待測(cè)粗酶液。反應(yīng)體系中依次加入0.2m L 0.2mol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5），0.3m L 1%PGA（多聚半乳糖醛酸）溶液，0.1m L酶提取液和0.4m L H2O。反應(yīng)體系經(jīng)37℃水浴60m in后加入1m L DNS（3，5-二硝基水楊酸）終止反應(yīng)，于沸水中顯色5m in，加雙蒸水定容至10m L，搖勻后于540nm處測(cè)吸光值。以37℃時(shí)單位重量鮮果在單位時(shí)間內(nèi)分解果膠產(chǎn)生1μg的游離半乳糖醛酸為一個(gè)果膠酶活性單位（U），每個(gè)處理平行測(cè)定3次。

1.6 果膠裂解酶（PL）活性的測(cè)定

參照Baldwin等[14]的方法。將冷凍葡萄樣品研磨成粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g，加4m L預(yù)冷的20mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.0，內(nèi)含0.02mmol/L cysteine-HCl、0.02mmol/L EDTA和0.05%Triton X-100），12000r/m in 4℃條件下離心20m in，上清液為待測(cè)粗酶液。反應(yīng)體系中依次加入1m L 4mmol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.5）、1.5m L 1%PGA（pH4.5）和0.5m L酶提取液。反應(yīng)體系經(jīng)37℃水浴30m in后沸水浴2m in，搖勻后于235nm處測(cè)吸光度值，以37℃時(shí)單位重量鮮果在單位時(shí)間內(nèi)分解果膠產(chǎn)生1μg的游離半乳糖醛酸為一個(gè)酶活性單位（U），每個(gè)處理平行測(cè)定3次。

1.7 纖維素酶（Cx）活性的測(cè)定

參照Lohani的方法[15]。將冷凍葡萄樣品研磨成粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g，加4m L預(yù)冷的0.05mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH4.5，內(nèi)含7.5g/100m L NaCl和0.5g/L PVP），充分浸提20～30m in，12000r/m in 4℃下離心20m in，上清液為待測(cè)粗酶液。取1m L酶液，40℃預(yù)熱3m in后，加入2m L CMC（羥甲基纖維素鈉作底物）。于40℃水浴60min后加入1m L DNS終止反應(yīng)，立即放入沸水中顯色5m in，用冰水冷卻，以雙蒸水定容至10m L，混勻后于540nm處測(cè)吸光值。以40℃時(shí)每分鐘每克樣品分解羥基甲纖維素鈉產(chǎn)生1μg的葡萄糖為1個(gè)纖維素酶活力單位（U），每個(gè)處理平行測(cè)定3次。

1.8 β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性的測(cè)定

參照Kluck等[16]的方法，稍作改動(dòng)。將冷凍葡萄樣品研磨成粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g，加4m L預(yù)冷的0.05mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5，內(nèi)含100mmol/L NaCl，1%的β-巰基乙醇），充分浸提20～30m in，12000r/m in 4℃下離心20m in，取上清液為待測(cè)粗酶液。反應(yīng)體系依次加入0.1m L酶液，2m L 3mmol/L 4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（以pH4.7的0.05mmol/L醋酸鈉緩沖液配制），40℃恒溫水浴60m in，然后加入2m L 1mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于400nm處測(cè)吸光值。對(duì)照為不保溫直接加入Na2CO3溶液。以40℃時(shí)每分鐘每克鮮樣釋放1μg的硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位（U），每個(gè)處理平行測(cè)定3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Sigma Plot 10.0軟件作圖。各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)得值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（S.E.）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙組份SO2-ClO2對(duì)果膠含量的影響

果膠存在于一切高等植物中[4]，沉積在初生細(xì)胞壁與細(xì)胞間層，在初生壁中和不同含量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及一些伸展蛋白相互交聯(lián)，從而使各種細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬，表現(xiàn)出其固有的形態(tài)，果實(shí)中總果膠含量越高，果實(shí)硬度就越大。

圖1和圖2為貯藏期內(nèi)葡萄果實(shí)中果膠物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)。由圖1和圖2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，紅提葡萄果實(shí)細(xì)胞壁的構(gòu)成成分相應(yīng)發(fā)生變化，果實(shí)內(nèi)總果膠含量逐漸減少，水溶性果膠增加。不同處理的果實(shí)，總果膠變化呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，其中以對(duì)照下降速度最快，至50d時(shí)由最初的2.08%變化為0.63%，而經(jīng)雙組份處理的果實(shí)，其下降速度較為緩慢，變化量?jī)H為對(duì)照果實(shí)的71.84%?？偣z的降解增大了細(xì)胞壁的網(wǎng)絡(luò)孔徑，導(dǎo)致細(xì)胞壁膨脹，增加酶對(duì)底物的接觸，從而加速了細(xì)胞的解體過(guò)程，最終導(dǎo)致果實(shí)軟化。水溶性果膠含量則隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，保鮮紙?zhí)幚淼墓麑?shí)其增加速度相對(duì)緩慢，以雙組份SO2-ClO2效果最佳，至貯藏期50d時(shí)變化量為1.74%，僅為對(duì)照的75%。與對(duì)照相比，保鮮紙?zhí)幚砜梢詼p少總果膠物質(zhì)的分解，延緩可溶性果膠增加的速度，從而可抑制半乳糖醛酸和阿拉伯糖從細(xì)胞壁中分解，對(duì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整起保護(hù)性作用。

圖1 不同處理對(duì)果實(shí)原果膠的影響Fig.1 Effectof different treatmenton contentof total pectin in Red Globe grape

圖2 不同處理對(duì)果實(shí)可溶性果膠的影響Fig.2 Effectof different treatmenton contentof soluble pectin in Red Globe grape

2.2 雙組份SO2-ClO2對(duì)果實(shí)PME活性的影響

果膠酯酶（PME）廣泛的存在于高等植物中，并以多種形式分布在植物組織內(nèi)，可去除果膠分子鏈上半乳糖醛酸羧基上的酯化基團(tuán)（主要為羥甲基或羥乙基），使高度甲酯化的糖醛酸殘基形成多聚半乳糖醛酸及甲醇，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，形成PG作用的底物，從而PME被認(rèn)為與果實(shí)的軟化啟動(dòng)相關(guān)[6]。

圖3為貯藏期內(nèi)不同處理對(duì)果實(shí)內(nèi)PME活性變化的影響，從圖3可知，PME活性呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，以對(duì)照上升速度最快，貯藏期結(jié)束時(shí)為最初活性的5倍之多，PME活性上升將導(dǎo)致細(xì)胞壁果膠物質(zhì)甲酯化的程度呈降低趨勢(shì)，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成水溶性的果膠，因此加速了果膠水解及果實(shí)軟化。而保鮮紙?zhí)幚碓谝欢ǔ潭壬弦种屏似咸压麑?shí)PME活性上升的速度，由此可減緩果實(shí)軟化的速度，且兩種保鮮紙?zhí)幚頍o(wú)顯著差異（p＞0.05），與對(duì)照存在顯著差異（p＜0.05）。

圖3 不同處理對(duì)果實(shí)PME活性的影響Fig.3 Effectof different treatmenton PME activity in Red Globe grape

2.3 雙組份SO2-ClO2對(duì)果實(shí)PG活性的影響

多聚半乳糖醛酸酶（PG）是一類(lèi)重要的水解酶，主要功能為催化細(xì)胞壁果膠酸1，4-2-D-半乳糖苷鍵的裂解，生成低聚的半乳糖醛酸或半乳糖醛酸，致使細(xì)胞壁解體，果實(shí)軟化[17-19]。按PG對(duì)底物的作用方式不同可將其分為3種：a.內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG，以內(nèi)切方式隨機(jī)從分子中間切斷多聚半乳糖醛酸鏈）；b.外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）；c.寡聚半乳糖醛酸酶（oligo-PG）。后兩者則以一種外切方式有順序地從半乳糖醛酸多聚鏈或寡聚鏈的非還原端釋放出1個(gè)單體或1個(gè)二聚體，產(chǎn)生半乳糖醛酸[20]。

圖4 不同處理對(duì)果實(shí)PG活性的影響Fig.4 Effect of different treatment on PG activity in Red Globe grape

圖4為貯藏期紅提葡萄果實(shí)內(nèi)PG活性的變化趨勢(shì)圖。由圖4可知，對(duì)照果實(shí)PG活性急劇上升，至貯藏期50d時(shí)增至31.94U·g-1·FW，為初期的3倍之多。單組份SO2處理在貯藏初期上升速度較快，第20d增至15.9U·g-1·FW，隨后則增加的較為緩慢。雙組份SO2-ClO2處理對(duì)PG活性的抑制作用較為明顯，整個(gè)過(guò)程上升了1倍，顯著低于對(duì)照和單組份SO2保鮮紙?zhí)幚恚╬＜0.05），由此可以說(shuō)明，雙組份SO2-ClO2可對(duì)PG活性有抑制作用，減緩原果膠向可溶性果膠轉(zhuǎn)化的速度，從而減輕對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，延緩果實(shí)軟化的速度。

2.4 雙組份SO2-ClO2對(duì)果實(shí)PL活性的影響

果膠裂解酶（PL）是細(xì)胞壁重要的水解酶之一，它只能水解靠近甲酯基的α-1，4-糖苷鍵，反應(yīng)遵循β-消除代替水解斷裂，在非還原末端的C4和C5位置生成有不飽和鍵的半乳糖醛酸，而在還原性末端則與PG水解的情況相同，即在分解效果的表觀上PL與PG是一樣的，都可使還原糖含量增高和粘度降低[3]。

由圖5可知，不同處理紅提葡萄果實(shí)內(nèi)PL活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中以對(duì)照上升幅度最大，在第30d峰值為91.7U·g-1·FW，隨后急劇下降。保鮮紙?zhí)幚碓谝欢ǔ潭壬峡梢砸种芇L酶活性上升的速度，減緩對(duì)細(xì)胞壁的傷害，但單組份SO2保鮮紙?zhí)幚韺?duì)PL酶活的抑制作用比雙組份SO2-ClO2的顯著（p＜0.05），其中的作用機(jī)理還有待于研究。

圖5 不同處理對(duì)果實(shí)PL活性的影響Fig.5 Effectof different treatmenton PL activity in Red Globe grape

2.5 雙組份SO2-ClO2對(duì)果實(shí)Cx活性的影響

纖維素酶（Cx）是一種細(xì)胞壁水解酶，在細(xì)胞壁降解過(guò)程中起著重要作用，該酶能夠分解含β-1，4-糖苷鍵的半纖維素，但其卻不作用于非水溶性纖維素[21]。纖維素酶能對(duì)羧甲基纖維素、木葡聚糖及具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的物質(zhì)表現(xiàn)出活性，故又稱(chēng)為葡聚糖酶[22-23]。Cx主要存在于成熟的果實(shí)中，在未成熟的果實(shí)中其活性很低或幾乎檢測(cè)不到，且許多研究認(rèn)為它與果實(shí)早期成熟的軟化啟動(dòng)有著緊密的聯(lián)系。

圖6 不同處理對(duì)果實(shí)Cx活性的影響Fig.6 Effectof different treatmenton Cx activity in Red Globe grape

圖6為貯藏過(guò)程中不同處理對(duì)紅提葡萄果實(shí)中Cx酶活性變化的影響，由圖6可知在整個(gè)貯藏期內(nèi)，Cx活性呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，以對(duì)照上升最快，雙組份SO2-ClO2上升速度最為緩慢。至貯藏期50d時(shí)，對(duì)照活性可達(dá)到31.47U·g-1·FW，其活性為雙組份SO2-ClO2處理果實(shí)的2倍。由此表明SO2-ClO2保鮮紙?zhí)幚砜梢砸种艭x酶活性的上升速度，減輕細(xì)胞壁物質(zhì)降解所引起的細(xì)胞壁總體結(jié)構(gòu)的破壞，從而可延緩果實(shí)的軟化。

2.6 雙組份SO2-ClO2對(duì)果實(shí)β-Gal活性的影響

β-半乳糖苷酶主要作用于屬李半乳聚糖骨架支鏈的殘基，降解果膠的聚合體，破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性。研究表明β-半乳糖苷酶在果實(shí)軟化的早期含量最為豐富，其能降解果膠物質(zhì)中的半乳聚糖，使半乳糖和阿拉伯殘基從細(xì)胞壁中分解，攻擊細(xì)胞壁的完整性[24]。該酶即使在無(wú)果膠酶作用時(shí)也可使細(xì)胞壁喪失原有的特性，活化的β-半乳糖苷酶也能幫助纖維素酶完成果實(shí)的軟化。

圖7 不同處理對(duì)果實(shí)β-Gal活性的影響Fig.7 Effectof different treatmentonβ-Gal activity in Red Globe grape

圖7為貯藏期葡萄果實(shí)內(nèi)β-Gal活性的變化趨勢(shì)，由圖7可知，在貯藏前40d內(nèi)β-Gal呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，之后其活性變化不大。不同處理間以對(duì)照上升的速度最快，在第20d達(dá)到峰值8.15U·g-1·FW，隨后活性直線下降，且維持在較低水平。經(jīng)保鮮紙?zhí)幚淼钠咸压麑?shí)，其活性上升得到抑制，至貯藏期30d時(shí)雙組份SO2-ClO2為6.71U·g-1·FW，單組份SO2為6.39U·g-1·FW，顯著低于對(duì)照果（p＜0.05），且峰值出現(xiàn)的時(shí)間推遲了10d，可對(duì)維持細(xì)胞壁完整性起保護(hù)作用。

2.7 葡萄果實(shí)貯藏中細(xì)胞壁軟化酶活性和果膠含量的相關(guān)性分析

對(duì)紅提葡萄果實(shí)對(duì)照樣品中果膠與細(xì)胞壁軟化酶進(jìn)行相關(guān)性分析可知（表1）：總果膠（TP）與水溶性果膠（WSP）、PG、Cx存在顯著負(fù)相關(guān)性，也與PME存在極顯著的負(fù)相關(guān)性；WSP與PME、Cx存在顯著正相關(guān)性，同時(shí)與PG存在極顯著正相關(guān)性，表明PME、Cx、PG協(xié)同作用于細(xì)胞壁，可促進(jìn)總果膠向水溶性果膠的轉(zhuǎn)化。PG與PME、Cx、WSP存在極顯著正相關(guān)性，與TP呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明紅提葡萄果實(shí)在貯藏期間細(xì)胞壁軟化酶和果膠是相互關(guān)聯(lián)的，在果實(shí)軟化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此我們推測(cè)雙組份SO2-ClO2處理可直接抑制PG、PME、Cx的活性來(lái)減緩果膠的水解，降低果實(shí)細(xì)胞壁的降解而進(jìn)一步延緩果實(shí)的軟化。

2.8 葡萄果實(shí)貯藏中細(xì)胞壁軟化酶活性和果膠含量的回歸分析

對(duì)紅提葡萄果實(shí)對(duì)照樣品進(jìn)行回歸分析可知（表2）：回歸方程是準(zhǔn)確的?；貧w分析進(jìn)一步表明：總果膠（TP）與PME呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)，說(shuō)明TP的含量與PME的活性相關(guān)，PME能催化、水解果膠生成果膠酸和甲醇，增加總果膠在水中的溶解度；水溶性果膠（WSP）與PG為顯著正相關(guān)，但未得到PL與果膠的回歸方程，表明細(xì)胞壁的軟化被PME、PG直接調(diào)控。PG活性的增加有助于WSP含量的積累，從而加速細(xì)胞的解體過(guò)程。因此推測(cè)SO2-ClO2可通過(guò)抑制紅提葡萄果實(shí)中PG、PME等細(xì)胞壁軟化酶的活性，減緩原果膠向水溶性果膠的轉(zhuǎn)換，降低果膠的水解速度，較好的保持細(xì)胞壁的完整性，從而保持果實(shí)的硬度。

3 討論

表1 葡萄果實(shí)中果膠和細(xì)胞壁軟化酶的相關(guān)分析Table1 The correlation analysis between pectin and cellwall enzyme activities

表2 葡萄果實(shí)細(xì)胞壁軟化酶和果膠的回歸分析Table2 The regression analysis between cellwall enzyme activities and pectin

果實(shí)的成熟軟化是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，其間經(jīng)歷了一系列生理生化的變化，包括細(xì)胞壁的降解，內(nèi)含物的變化等。許多研究表明SO2和ClO2單獨(dú)處理能使果實(shí)在貯藏期保持較高的硬度，維持果實(shí)品質(zhì)，如葡萄、枇杷、桃等[25-27]。因此可更深入地研究SO2和ClO2結(jié)合處理對(duì)果實(shí)軟化影響的機(jī)理。果實(shí)的細(xì)胞壁主要成分是果膠、纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)。其果膠物質(zhì)有三種形態(tài)：原果膠、果膠及果膠酸。原果膠不具水溶性，成熟果實(shí)質(zhì)地的堅(jiān)硬程度與原果膠含量相關(guān)。隨著果實(shí)的衰老，總果膠被分解為果膠，果膠進(jìn)一步被分解為果膠酸，造成細(xì)胞間的連接變得松弛，果實(shí)硬度下降。果膠及果膠酸的膠粘能力差，使細(xì)胞間的結(jié)合力變小，果實(shí)質(zhì)地變軟。在果實(shí)成熟過(guò)程中，PG酶與果實(shí)軟化密切相關(guān)，果實(shí)的成熟軟化伴隨著PG酶活性提高和果膠的降解。PME能催化、水解果膠生成果膠酸和甲醇，通過(guò)去除果膠分子鏈上的半乳糖醛酸羧基上的酯化基團(tuán)，增加果膠在水中的溶解度。研究表明SO2和SO2-ClO2處理減緩了PG酶活增加的速度，還抑制了PG的最大酶活性。PG的作用底物是多聚半乳糖醛酸（果膠酸），而果膠中多聚半乳糖醛酸殘基通常是被甲氧基化的，要使PG有效地起作用，首先必須有果膠甲酯酶（PME）使果膠脫去甲氧基。因此，果膠的水解是在PG和PME協(xié)同作用下完成的[20]。SO2和SO2-ClO2處理均抑制了紅提葡萄貯藏過(guò)程中果實(shí)內(nèi)PG、PME和PL的活性，從而延緩了葡萄果實(shí)的軟化速度。纖維素是細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)，果實(shí)在成熟軟化過(guò)程中伴隨著纖維素的降解。Cx可將纖維素水解為低分子糖類(lèi)，導(dǎo)致果實(shí)細(xì)胞壁的降解，果實(shí)軟化。在果實(shí)成熟的過(guò)程中，細(xì)胞壁發(fā)生的重要變化就是細(xì)胞壁多聚物中半乳糖殘基的降解。本研究的結(jié)果表明，SO2和SO2-ClO2處理能抑制果實(shí)Cx和β-半乳糖苷酶活性的增加，延緩果膠和纖維素的降解，保持果實(shí)硬度。

4 結(jié)論

紅提葡萄果實(shí)的成熟軟化與果膠質(zhì)的降解密切相關(guān)，果膠質(zhì)的降解過(guò)程除了受果膠軟化酶的直接調(diào)控外，纖維素酶對(duì)其也有重要影響。雙組份SO2-ClO2保鮮紙可抑制果實(shí)內(nèi)原果膠（TP）的水解，減緩可溶性果膠（WSP）的增加，延緩果實(shí)硬度的降低；同時(shí)可抑制果膠甲酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠裂解酶（PL）、纖維素酶（Cx）和β-半乳糖苷酶（β-Gal）等幾種細(xì)胞壁軟化相關(guān)酶的活性的增加，從而可延緩果膠和纖維素的降解，較好保持葡萄果實(shí)的硬度，延長(zhǎng)紅提葡萄果實(shí)的貨架期。

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