姜福佳，呂 爽，逯家富

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130033）

隨著社會(huì)發(fā)展的不斷進(jìn)步，人們?cè)絹碓街匾暯】担烊?、綠色食品逐漸被人們青睞，啤酒糟中的色素是一種天然色素，可以作為食品和許多生活用品中的著色劑，并且具有很強(qiáng)的生理活性[1-2]。

啤酒糟是啤酒工業(yè)的副產(chǎn)品，其中含有豐富的粗蛋白和色素，營養(yǎng)價(jià)值較高。目前，啤酒糟多用來添加到動(dòng)物的飼料中，沒有使啤酒糟的綜合利用價(jià)值得到充分的提高。因此，我們以啤酒糟為原料，提取其中的色素具有重大意義[3-7]。

超臨界流體萃取是一種新型的提取分離技術(shù)，它是利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行提取。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地按極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小依次將成分萃取出來。然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的，所以超臨界流體萃取過程是由萃取和分離組合而成，從多種液態(tài)或固態(tài)混合物中萃取出待分離的組分[8-9]。由于響應(yīng)面分析法精確度高、優(yōu)化效果好[10]，所以，本研究用超臨界CO2流體萃取法提取色素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于超臨界CO2流體萃取色素的工藝優(yōu)化，以提高色素的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒糟 烘干、粉碎（80目）華潤(rùn)雪花啤酒長(zhǎng)春有限公司；原花色素 河北百味生物科技有限公司；CO2液化氣 純度99.9%以上，長(zhǎng)春巨洋氧氣廠；無水乙醇（分析醇） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱 河北黃驊航天儀器廠；多功能粉碎機(jī) 上海廣沙工貿(mào)有限公司；A221-50-06型CO2超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界有限公司；UV-2401 PC型紫外可見分光光度計(jì) 島津公司；721型紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 萃取溫度對(duì)色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度分別為25、30、35、40、45、50、55℃的條件下，按萃取壓力30MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量為25L/h萃取啤酒糟90m in，收集色素，測(cè)定吸光度，計(jì)算色素含量。

1.2.1.2 萃取壓力對(duì)色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度40℃，萃取壓力分別為10、15、20、25、30、35MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量為25L/h的條件下萃取啤酒糟90min，收集色素，測(cè)定吸光度，計(jì)算色素含量。

1.2.1.3 CO2流量對(duì)色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度40℃，萃取壓力30MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量分別為10、15、20、25、30、35、40L/h的條件下萃取啤酒糟90min，收集色素，測(cè)定吸光度，計(jì)算色素含量。

1.2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)色素含量的影響 稱取啤酒糟100g，裝入萃取釜中，在萃取溫度40℃，萃取壓力30MPa（分離Ⅰ、分離Ⅱ溫度和壓力分別為30℃、9MPa和30℃、6MPa），CO2流量25L/h的條件下，分別對(duì)啤酒糟萃取60、90、120、150、180、210m in，收集色素，測(cè)定吸光度，計(jì)算色素含量。

1.2.2 啤酒糟色素提取物的紫外-可見分析圖譜 將實(shí)驗(yàn)所提取的色素稀釋，在紫外可見光區(qū)波長(zhǎng)200～ 800nm下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，物質(zhì)在280nm下有最大吸收峰，說明物質(zhì)中含原花色素的某些成分。色素提取物的紫外分析圖譜見圖1。

圖1 色素提取物的紫外分析圖譜Fig.1 The pigmentextractuvmap analysis

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 稱取10mg原花色素，配制成0.1mg/m L濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1、2、3、4、5、6m L，在10m L的棕色容量瓶中定容，所得色素的濃度分別是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg／m L。放入冰箱中平衡0.5h，用無水乙醇作為空白液，用紫外分光光度計(jì)在280nm處測(cè)其吸光度值。結(jié)果用最小二乘法做線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖2。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

式中：A—吸光度值；X—原花色素的濃度（mg/m L）。

1.2.4 色素含量的測(cè)定 超臨界CO2流體萃取出啤酒糟中的色素后，將萃取物離心分離，分離除去脂肪等雜質(zhì)，得到色素。吸取色素50μL，定容至5m L，在280nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算色素含量[11]。

色素含量（μg/g）=C280×V×稀釋倍數(shù)/E×M

式中：C280—為色素在280吸光度下的濃度（mg/m L）；V—為樣品溶液的總體積（m L）；E—為色素在無水乙醇中百分消光系數(shù)，2348；M—啤酒糟質(zhì)量（g）。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化色素提取的最佳工藝方法 本實(shí)驗(yàn)針對(duì)影響超臨界萃取效果的主要因素——萃取溫度、萃取壓力、CO2流量以及萃取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定最佳的萃取時(shí)間，然后利用三因素三水平響應(yīng)面分析方法對(duì)啤酒糟中色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。依據(jù)最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Factors and levels of RSM analysis

2 結(jié)果與討論

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 萃取溫度對(duì)色素含量的影響結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3我們可以看出，萃取溫度對(duì)色素含量的影響顯著，啤酒糟中的色素含量隨著萃取溫度的升高而逐漸上升，當(dāng)萃取溫度為45℃時(shí)達(dá)到最大，之后色素含量隨溫度的升高逐漸下降，這應(yīng)該是因?yàn)?，在一定壓力下，溫度升高，CO2密度降低，溶解能力下降[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)所得的最佳萃取溫度是45℃。

圖3 萃取溫度對(duì)色素含量的影響Fig.3 Effectof content temperature on pigment production rate

2.1.2 萃取壓力對(duì)色素含量的影響結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，由圖4我們可以看出，隨著萃取壓力的增加，色素的含量逐漸增大，當(dāng)壓力為30MPa時(shí)，色素的含量最高，當(dāng)萃取壓力高于30MPa后，色素的含量有所下降，這應(yīng)該是因?yàn)椋瑴囟纫欢〞r(shí)，壓力增大，超臨界流體密度增大，對(duì)溶質(zhì)的溶解能力越大，萃取趨于完全。當(dāng)壓力增至一定程度時(shí)，CO2溶解能力增加緩慢，色素的收率增加不大甚至降低[11]，因此，本實(shí)驗(yàn)中最佳萃取壓力為30MPa。

圖4 萃取壓力對(duì)色素含量的影響Fig.4 Effect of content pressure on pigment production rate

2.1.3 CO2流量對(duì)色素含量的影響結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5我們可以看出，隨著CO2流量的升高，色素含量逐漸增大，當(dāng)CO2流量為30L/h時(shí)，色素含量最高，然后隨著CO2流量的繼續(xù)升高，色素的含量有所下降，主要是由于CO2流量的增加提高了傳質(zhì)速率，增大萃取能力，提高了萃取效率，從而縮短萃取時(shí)間。萃取后期，由于萃取對(duì)象中待分離組分含量減少，故萃取量又降低。同時(shí)，CO2流量過大會(huì)導(dǎo)致CO2停留時(shí)間過短，反而使色素含量降低[13]，因此，通過實(shí)驗(yàn)，我們確定最佳CO2流量是30L/h。

圖5 CO2流量對(duì)色素含量的影響Fig.5 Effect of CO2 flow rate on pigment production rate

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)色素含量的影響結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6我們可以看出，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，色素的含量逐漸增大，當(dāng)萃取時(shí)間為150min時(shí)，色素的含量最高，隨著萃取時(shí)間的繼續(xù)增加，色素含量的增加幅度減小，近于平衡[14]，因此，最佳的萃取時(shí)間為150m in。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化色素提取的最佳工藝結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們確定最佳萃取時(shí)間為定量150min，以萃取溫度、萃取壓力、CO2流量三個(gè)因素作為自變量，以色素含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖6 萃取時(shí)間對(duì)色素含量的影響Fig.6 Effectof content time on pigment production rate

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 The experiment design and results of RSM

采用多元二次回歸方程擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再用F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析工具和響應(yīng)面圖研究考察因子之間的交互關(guān)系及因子與響應(yīng)值間的關(guān)系。最后采用導(dǎo)數(shù)求極值法求得色素提取的最優(yōu)條件。

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得色素含量對(duì)編碼自變量萃取溫度、萃取壓力和CO2流量的二次多項(xiàng)回歸方程：

回歸分析結(jié)果見表3，其響應(yīng)面圖見圖7。通過SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，得R2為97.81%，說明回歸方程可以較好地描述考察因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。根據(jù)p值可以看出，萃取溫度對(duì)色素含量的影響高度顯著，失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），一次項(xiàng)X1、X2、X3，二次項(xiàng)X、X1X2、X、X均顯著，說明它們對(duì)響應(yīng)值影響較大。根據(jù)F值，我們可以判斷影響色素含量大小的順序依次為：萃取溫度＞萃取壓力＞CO2流量。

表3 回歸分析結(jié)果Table3 The results of regression analysis

圖7 （a）Y=f（X1，X2），（b）Y=f（X1，X3）和（c）Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面圖Fig.7 Responsive surface graphs of（a）Y=f（X1，X2），（b）Y=f（X，X）and（c）Y=f（X，X）

圖7直觀地描繪出影響因素間交互作用的響應(yīng)面曲面圖。由圖7響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線我們可以看出，在所選的范圍存在極值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)與等高線的中心點(diǎn)重合，圖7（a）表明，X1和X2交互作用顯著，X1較大的同時(shí)X2減小，Y值便會(huì)減小，即萃取溫度升高，萃取壓力降低，導(dǎo)致色素的含量降低，這可能是由于溫度升高后，CO2密度降低，溶解能力下降，壓力同時(shí)減小，所以色素的含量降低。SAS軟件系統(tǒng)給出了能夠得到最大響應(yīng)值的X1、X2、X3分別為X1= 46.3、X2=30.7、X3=29.5。即當(dāng)萃取溫度46.3℃，萃取壓力30.7MPa，CO2流量為29.5L/h時(shí)色素含量最高，為67.2μg/g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

我們進(jìn)一步修改了響應(yīng)面優(yōu)化所得的最佳工藝參數(shù)，修整為萃取溫度45℃，萃取壓力30MPa，CO2流量30L/h，做三組平行的超臨界CO2萃取實(shí)驗(yàn)，三組平行實(shí)驗(yàn)的色素含量分別是66.3、64.8、66.7μg/g，平均含量為65.9μg/g，與理論值的相對(duì)誤差為1.9%，因此，模型能較好地預(yù)測(cè)色素的含量。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化影響色素含量的三種因素：萃取溫度、萃取壓力和CO2流量，通過回歸分析，我們得到萃取溫度對(duì)色素含量的影響高度顯著，同時(shí)，通過多元二次回歸方程得出最優(yōu)的提取條件，即萃取溫度45℃，萃取壓力30MPa，CO2流量30L/h，最終所得啤酒糟中色素含量為65.9μg/g。本次實(shí)驗(yàn)，我們不僅得到了色素，同時(shí)除去了干啤酒糟中所含有的大量脂肪，為進(jìn)一步提取蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

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