劉濤　張俊會(huì)　李娜

[摘要] 目的 探討木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及HSP70 mRNA、Fas mRNA表達(dá)的影響。 方法 Wistar大鼠60例，隨機(jī)分為對照組、模型組及木犀草素高、中、低劑量組。對照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；模型組及木犀草素高、中、低劑量組采用高脂高糖飲食加腹腔注射小劑量鏈脲霉素建立糖尿病大鼠模型，造模后，木犀草素高劑量、中劑量、低劑量組每日分別給予木犀草素200、100、50 mg/kg灌胃，模型組每日給予生理鹽水2 mL灌胃，連續(xù)8周。再以線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈永久性缺血模型，術(shù)后24 h斷頭取腦，用TUNEL法和原位雜交法觀察大鼠腦細(xì)胞凋亡與腦組織HSP70 mRNA及Fas mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 木犀草素低、中、高劑量組糖尿病腦梗死神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)分別為（16.42±1.39）、（11.08±2.15）、（9.25±1.98）個(gè)/高倍視野低于模型組[（29.75±2.36）個(gè)/高倍視野]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；HSP70 mRNA在模型組表達(dá)[（9.75±2.766）個(gè)/高倍視野]顯著高于對照組[（0個(gè)/高倍視野）]（P < 0.01）；低、中、高三個(gè)劑量的木犀草素組HSP70 mRNA表達(dá)分別為（11.33±2.15）、（13.92±2.15）、（14.92±1.95）個(gè)/高倍視野，均高于模型組[（9.75±2.76）個(gè)/高倍視野]（均P < 0.01）；Fas mRNA在模型組大鼠腦組織陽性細(xì)胞數(shù)[（25.33±3.17）個(gè)/高倍視野]顯著高于對照組[（2.67±0.95）個(gè)/高倍視野]（P < 0.01）；高、中、低劑量木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細(xì)胞數(shù)分別為（11.92±2.41）、（12.00±2.50）、（19.75±2.54）個(gè)/高倍視野，顯著低于模型組[（25.33±3.17）個(gè)/高倍視野]（均P < 0.01）。 結(jié)論 木犀草素可以抑制糖尿病腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與木犀草素升高大鼠腦組織HSP70 mRNA表達(dá)，同時(shí)使Fas mRNA的表達(dá)降低有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病；腦梗死；木犀草素；HSP70 mRNA；Fas mRNA

[中圖分類號(hào)] R743.32 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（a）-0021-03

缺血性腦損傷后會(huì)出現(xiàn)多種病理改變，壞死是引起梗死中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要原因，而凋亡則是導(dǎo)致梗死半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要因素[1]。凋亡細(xì)胞主要存在于半暗帶區(qū)，因而凋亡能夠影響最后腦梗死的面積[2]。HSP70是一種細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白，主要參與機(jī)體耐受的形成[3-4]，有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Fas基因是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要基因[5-6]。木犀草素（Luteolin）最初是從草本植物木犀草的葉、莖、枝中被分離出而得名，其具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗過敏、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用。為此，本實(shí)驗(yàn)在于觀察木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及HSP70 mRNA、Fas mRNA表達(dá)的影響，以探討木犀草素對糖尿病腦梗死大鼠腦損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和藥品

雄性Wistar大鼠60只，體重180～230 g。來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2009-0003。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（TUNEL）、HSP70及Fas原位雜交試劑盒均購于武漢博士德生物技術(shù)公司；木犀草素（98%）購于陜西慧科植物開發(fā)有限公司；鏈尿菌素（STZ）購于Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作 各組均先以高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，然后以STZ（30 mg/kg）腹腔注射1次，72 h后尾靜脈采血測定血糖，空腹血糖> 16.7 mol/L的大鼠判定為造模成功。以線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型[7]。大鼠成功麻醉后，頸部正中切口，暴露并鈍性游離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動(dòng)脈（ECA）分叉部，距頸總動(dòng)脈分叉處近心端5 mm處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產(chǎn)尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，以頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算進(jìn)線深度為18 mm左右，至大腦中動(dòng)脈起始部以完全阻斷血供，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈并固定魚線。術(shù)中，用加熱墊和燈泡保持肛溫在37.0～37.5℃。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 60只Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組：對照組、模型組及木犀草素高、中、低劑量組，每組各12只。糖尿病性動(dòng)物模型制備后，開始灌胃給藥，木犀草素高劑量、中劑量、低劑量組每日分別給予木犀草素200、100、50 mg/kg灌胃，模型組與對照組每日給予生理鹽水2 mL灌胃，連續(xù)8周。每組大鼠于MCAO術(shù)后24 h斷頭取腦，用TUNEL法和原位雜交法觀察大鼠腦細(xì)胞凋亡與腦組織HSP70 mRNA及Fas mRNA的表達(dá)。

1.2.3 原位凋亡細(xì)胞檢測 各實(shí)驗(yàn)組大鼠斷頭取腦后，將腦組織置于4%的多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，做連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。TUNEL染色按試劑盒說明操作，細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)于高倍鏡（40×10）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.4 HSP70 mRNA及Fas mRNA測定 采用原位雜交法，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，DAB顯色蘇木素復(fù)染。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：HSP70 mRNA及Fas mRNA表達(dá)于細(xì)胞漿，以棕黃色顆粒為陽性。以高倍鏡（40×10）觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用方差分析，組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)

TUNEL陽性細(xì)胞分布在腦梗死半暗帶區(qū)，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為胞核固縮，呈棕褐色。本實(shí)驗(yàn)中對照組無凋亡細(xì)胞，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組（P < 0.01）；木犀草素高、中、低劑量三組凋亡細(xì)胞數(shù)均低于模型組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；木犀草素三組中隨藥物劑量加大凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少，高、中劑量組及中、低劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠腦組織中HSP70 mRNA、Fas mRNA的表達(dá)

對照組HSP70 mRNA無表達(dá)，模型組HSP70 mRNA的表達(dá)顯著高于對照組（P < 0.01）；低、中、高三個(gè)劑量的木犀草素組HSP70 mRNA表達(dá)均高于模型組（均P < 0.01）。高、中劑量木犀草素組之間及中、低劑量劑量木犀草素組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。Fas mRNA在模型組大鼠腦組織陽性表達(dá)高于對照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；高、中、低劑量木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組（均P < 0.01）；高、中劑量木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于小劑量木犀草素組（均P < 0.01）。見表1。

3 討論

腦梗死后亞急性期和慢性期病變進(jìn)一步加重的重要原因之一是神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，急性腦缺血缺氧損傷后繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要方式[8-9]。細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死，又稱為程序性死亡，是機(jī)體清除衰老和損傷的細(xì)胞以保持內(nèi)環(huán)境平衡的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制。腦缺血后，缺血中心區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞因?yàn)橥耆毖l(fā)生不可逆轉(zhuǎn)地死亡，缺血周邊區(qū)尤其是缺血半暗帶內(nèi)因多種病理因素而激活凋亡通路，使細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。因此挽救半暗帶內(nèi)受損的神經(jīng)元，對治療缺血性腦血管疾病就顯得尤為重要。細(xì)胞凋亡受一系列基因的調(diào)控，HSP70與Fas基因是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的兩個(gè)重要基因。HSP70在正常大鼠腦內(nèi)并不存在，但在腦缺血、缺氧等誘導(dǎo)下其表達(dá)增加，HSP70的高表達(dá)是腦受到保護(hù)的標(biāo)志[10]。而Fas基因是重要的促凋亡因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對照組大鼠腦內(nèi)無HSP70 mRNA陽性細(xì)胞，表明在正常情況下腦內(nèi)無HSP70 mRNA的表達(dá)。在糖尿病腦梗死模型組大鼠腦組織中HSP70 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對照組大鼠腦內(nèi)有少數(shù)Fas mRNA陽性細(xì)胞，在模型組大鼠腦組織中Fas mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是一遲發(fā)性病變，因而尋求抑制腦缺血后神經(jīng)元過度凋亡的有效藥物是實(shí)現(xiàn)腦缺血后腦保護(hù)的一條重要途徑。木犀草素是存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有包括抗凋亡在內(nèi)的多種生物作用。已有研究證明，木犀草素對大鼠早期糖尿病心肌病及實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的腎臟有保護(hù)作用[11-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低、中、高劑量木犀草素組HSP70 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于模型組；而三種劑量的木犀草素組大鼠腦組織Fas mRNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組；同時(shí)該實(shí)驗(yàn)凋亡細(xì)胞數(shù)檢測顯示，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組；木犀草素高、中、低劑量三組凋亡細(xì)胞數(shù)均低于模型組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；木犀草素三組中隨藥物劑量加大凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少，顯示有劑量依賴性。此結(jié)果提示木犀草素可增強(qiáng)HSP70 mRNA的表達(dá)，同時(shí)使Fas mRNA的表達(dá)減少，從而抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，達(dá)到對糖尿病腦梗死的腦組織的保護(hù)作用。

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（收稿日期：2013-10-17 本文編輯：衛(wèi) 軻）