顧健, 李佳川, 樊利娜

(西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院, 四川 成都 610041)

【特約專稿】

藏藥波棱瓜子總木脂素對(duì)刀豆球蛋白(ConA)致免疫性肝損傷小鼠保護(hù)作用及其機(jī)制探討

顧健, 李佳川, 樊利娜

(西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院, 四川 成都 610041)

目的:波棱瓜子是常見(jiàn)的用于治療肝病的藏藥, 療效確切. 前期研究表明, 總木脂素是波棱瓜子抗肝損傷的有效部位, 但療效尚不明確. 本研究擬考察藏藥波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用, 并進(jìn)一步探討其對(duì)抗肝損傷的作用機(jī)制.方法:采用尾靜脈注射一次性ConA(20mg/kg)誘發(fā)小鼠免疫性肝損傷, 造模8h后取血樣和肝臟, 考察不同劑量的波棱瓜子總木脂素對(duì)各組小鼠臟器系數(shù)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、骨過(guò)氧化物酶(MPO)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等生化指標(biāo)活力或水平的影響; 以HE染色對(duì)肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查; 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)波棱瓜子總木脂素對(duì)各組小鼠肝臟中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響.結(jié)果:波棱瓜子總木脂素可以降低ConA所致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)及血清ALT、AST、ALP活力, 顯示出較好的保肝作用. 同時(shí)波棱瓜子總木脂素也可降低肝損傷小鼠血清NO水平和MPO、NOS活力, 并減少肝組織勻漿中MDA的含量, 增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性, 表現(xiàn)出良好的抗氧化作用; 免疫組化結(jié)果顯示, 波棱瓜子總木脂素還能抑制諸如TNF-α、IFN-γ、IL-4、NF-κB等促炎癥因子的表達(dá), 促進(jìn)抗炎癥因子IL-10的表達(dá), 從而抑制肝臟炎癥反應(yīng)而發(fā)揮其保肝作用. 病理觀察結(jié)果也表明, 波棱瓜子總木脂素能減輕ConA對(duì)肝組織的損傷.結(jié)論: 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致小鼠免疫性肝損傷都具有一定的保護(hù)作用,其保肝作用可能與其抗炎、抗氧化能力有關(guān).

波棱瓜子總木脂素; 免疫性肝損傷; 刀豆球蛋白A; 保肝; 抗炎; 抗氧化

研究表明, 以肝細(xì)胞炎癥、脂質(zhì)過(guò)氧化、肝功能異常為主要特點(diǎn)的肝臟損傷是各種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ), 一般多由病毒、藥物、毒劑、酒精、缺氧等因素引起. 肝損傷發(fā)病機(jī)制頗為復(fù)雜, 一般認(rèn)為有化學(xué)性和免疫性兩大類. 前者主要通過(guò)細(xì)胞色素P450及結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物產(chǎn)生損傷, 如改變質(zhì)膜的完整性、誘導(dǎo)線粒體功能失調(diào)、鈣超載誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降解酶的活性及自由基的作用等. 而免疫性肝損傷則主要是通過(guò)體內(nèi)各種細(xì)胞因子、一氧化氮、補(bǔ)體及免疫變態(tài)反應(yīng)等產(chǎn)生損傷. 如在病毒性肝炎中, 乙肝病毒(HBV)可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng), 并不直接殺傷肝細(xì)胞. 而是通過(guò)募集免疫效應(yīng)細(xì)胞至感染的肝臟細(xì)胞, 分泌各種炎癥、趨化、粘附因子, 一方面可清除入侵的HBV; 另一方面, 上述免疫活性物質(zhì)可進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞釋放出過(guò)量的炎癥因子, 造成更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng), 從而損傷肝細(xì)胞[1]. 而通過(guò)減少炎癥因子釋放, 抑制粘附分子表達(dá)等, 可不同程度減輕肝臟損傷, 為肝損傷的臨床治療提供了一個(gè)切實(shí)可行的切入點(diǎn).

流行病學(xué)調(diào)查表明, 肝損傷是嚴(yán)重危害人類健康的疾病臨床常見(jiàn)疾病之一. 而我國(guó)是各類肝病的高發(fā)區(qū)域,尤其以HBV感染最為常見(jiàn). 目前, 針對(duì)病毒性肝炎的治療, 現(xiàn)多提倡綜合治療, 雖然可以通過(guò)保護(hù)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,

減輕肝損傷, 減緩肝功能的衰退, 控制病情, 但尚無(wú)確切有效的藥物, 現(xiàn)有的藥物只是治標(biāo)不治本. 因此, 亟需尋找更為安全有效的藥物對(duì)抗肝臟損傷.

藏醫(yī)藥對(duì)肝病的治療已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注, 且有望從藏藥材中發(fā)現(xiàn)治療肝炎的藥材或新的先導(dǎo)化合物. 波棱瓜子為葫蘆科波棱瓜Herpetosperalga pedunculosumWal1．的干燥成熟種子, 始載于藏醫(yī)學(xué)著作《月王藥診》, 廣泛用于多種藏藥復(fù)方制劑, 其味苦, 性寒, 能清腑熱, 膽熱, 具有清熱解毒、去火降熱、助消化作用,用于治療赤巴病, 肝病(肝熱、黃疸型傳染性肝炎), 膽病以及消化不良[2-4]. 目前已報(bào)道, 波棱瓜子可用于治療乙型肝炎病毒、化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝損傷及肝癌等疾病. 前期藥效學(xué)研究也表明, 波棱瓜子具有較強(qiáng)抗乙肝病毒、保肝降酶活性, 發(fā)現(xiàn)并確定其抗肝炎的有效部位為總木脂素[5-7]. 然而, 波棱瓜子抗肝損傷的作用機(jī)理, 尚不十分清楚. 因此, 本研究以藏藥波棱瓜子總木脂素為研究對(duì)象, 采用ConA誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型, 選擇肝功能生化指標(biāo), 免疫功能觀察指標(biāo), 分別從脂質(zhì)過(guò)氧化, 免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子水平方面, 探討波棱瓜子總木脂素對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制, 以期為波棱瓜子總木脂素在病毒性肝炎等免疫性肝損傷中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 為逐步確定波棱瓜子治療肝病作用物質(zhì)基礎(chǔ), 擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍, 充分開(kāi)發(fā)利用這一藥用資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

波棱瓜子總木脂素, 由西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院提供; 聯(lián)苯雙酯滴丸, 浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司, 批號(hào): 20081107; 復(fù)方甘草酸苷片, 日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社, 批號(hào): 12084.

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠, SPF級(jí), 20±2g, 雄性, 動(dòng)物合格證號(hào): 動(dòng)物合格證號(hào): SCXK[川]2013-24, 購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心.

1.3 試劑

刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA), 美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品; ALT(批號(hào): 2013018)、AST(批號(hào): 2013018)、ALP(批號(hào): 2013003), 均購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司; NO(批號(hào): 20131010)、NOS(批號(hào): 20131010)、MPO(批號(hào): 20131009)、總蛋白(批號(hào): 20131010)、MDA(批號(hào): 20131011)、SOD(批號(hào): 20131010)、GSH-Px(批號(hào): 20131011),均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品; TNF-α(批號(hào): bs-2081R)、IFN-γ(批號(hào): bs-0480R)、IL-4(批號(hào): bs-0581R)、IL-10(批號(hào): bs-6761R), 均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司; NF-κB(批號(hào): BA1297), 武漢博世德生物工程有限公司; 生物素化山羊抗兔IgG(批號(hào): 13152A11), 北京中山金橋生物有限公司; 辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素(批號(hào): 13152A11), 北京中衫金橋生物有限公司; 濃縮型DAB顯色試劑盒(批號(hào): K135925C), 北京中衫金橋生物有限公司.

1.4 方法

1.4.1 主要試劑的配制

ConA劑量為20mg/kg, 應(yīng)用時(shí)無(wú)菌條件下, 溶于生理鹽水中制成1mg/ml的溶液.

1.4.2 動(dòng)物分組、給藥、造模

ICR小鼠, 雄性, 20±2g, 80只, 按體質(zhì)量分層, 隨機(jī)分成8組, 空白組、模型組、給藥組(0.375g/kg、0.75g/kg、1.5g/kg、3g/kg)、陽(yáng)性對(duì)照(聯(lián)苯雙酯200mg/kg、復(fù)方甘草酸苷片113mg/kg), 各組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量連續(xù)給藥7d, 末次給藥后1h, 除空白組, 其余各組一次性尾靜脈注射ConA20mg/kg, 誘導(dǎo)免疫性肝損傷[8-11].

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)

尾靜脈注射ConA后, 禁食不禁水8h, 小鼠取樣前稱重, 摘眼球取血后, 立即推頸處死, 解剖取出肝臟, 濾紙擦拭, 稱重, 計(jì)算肝臟系數(shù). 肝臟系數(shù)(%)=(肝臟質(zhì)量mg/體質(zhì)量g)×100%. 血樣室溫靜臵30min, 4000rpm/min、離心10min, 取上清, 備用. 按說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定血清ALT、AST、ALP、NO、NOS、MPO. 取上述肝臟組織, 一部分臵于10%福爾馬林溶液固定, 脫水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等, 最后鏡檢; 免疫組化法測(cè)定相關(guān)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、NF-κB、IL-4、IL-10. 陽(yáng)性表達(dá): 顏色為淺黃色或棕黃色, 陰性表達(dá)為藍(lán)色, 底色為

白色, 主要表達(dá)在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜, 或間質(zhì)等. 一部分制備成10%肝勻漿, 備用, 測(cè)定MDA、SOD、GSH-Px.

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝臟腫脹明顯. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能顯著降低ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠升高的肝臟系數(shù)水平(p<0.01). 結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響, n=10)Table 1 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表1 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響, n=10)Table 1 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

等：川西獐牙菜多糖的提取及含量測(cè)定組別 劑量/g·kg-1肝臟系數(shù)%空白 - 46.82±2.26**模型 - 62.12±6.19聯(lián)苯雙酯 0.2 52.98±3.44**復(fù)方甘草酸苷片 0.113 56.68±3.88**波棱瓜子木脂素0.375 55.64±4.050**0.75 54.73±2.10**1.5 54.82±2.51**3 52.91±1.73**

2.2 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清AST、ALT、ALP活力的影響

與空白組比較, 模型組小鼠血清中的AST、ALT、ALP活力明顯高于空白組, 表明ConA致免疫性肝損傷模型建立成功. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能降低免疫性肝損傷小鼠血清中的AST、ALT、ALP活力(p<0.05～0.01), 表明波棱瓜子總木脂素能夠降低ConA引起的酶活性升高, 減輕肝臟損傷程度. 結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響(, n=10)Table 2 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum ALT, AST and ALP of immunologic liver injury mice induced by ConA( , n=10)

表2 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響(, n=10)Table 2 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum ALT, AST and ALP of immunologic liver injury mice induced by ConA( , n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1ALT/U·L-1AST/U·L-1ALP/U·L-1空白 - 39.56±2.33**96.82±5.56**122.59±4.18**模型 - 213.1±2.96 218.29±6.70 220.68±34.63聯(lián)苯雙酯 0.2 174.93±13.90**170.18±11.64**149.84±22.39**復(fù)方甘草酸苷片 0.113 197.67±8.10*189.35±13.91**153.32±23.66**波棱瓜子木脂素0.375 176.05±21.81**175.94±16.20**118.68±21.37**0.75 147.06±10.21**171.59±13.81**133.10±32.89**1.5 178.61±17.33**164.47±22.90**125.06±19.07**3 163.65±18.42**159.06±23.52**110.90±19.32**

2.3 對(duì)肝臟組織病理學(xué)的影響

病理檢查結(jié)果顯示, 空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整, 未見(jiàn)點(diǎn)狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 肝內(nèi)未見(jiàn)纖維組織增生及假小葉形成; 模型組小鼠肝組織可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死及小灶性壞死, 肝小葉內(nèi)大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹, 伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn). 波棱瓜子總木脂素各劑量組、聯(lián)苯雙酯組、復(fù)方甘草酸苷片組均有一定程度的肝細(xì)胞損害, 輕度灶

性壞死, 濁腫, 與模型組比較, 損傷程度較輕, 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也減少, 提示波棱瓜子總木脂素能夠改善肝臟組織病變, 對(duì)免疫性肝損傷小鼠有很好的保護(hù)作用. 結(jié)果見(jiàn)圖1.

2.4 對(duì)小鼠血清NO含量、NOS活力的影響

表3 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清NO、NOS的影響(, n=10)Table 3 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum NO and NOS of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表3 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清NO、NOS的影響(, n=10)Table 3 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum NO and NOS of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1NO/umol·L-1NOS/U·ml-1空白 7.99±1.48**18.87±3.04**模型 15.39±1.53 29.98±2.45聯(lián)苯雙酯 0.2 10.35±1.74**23.66±2.08**復(fù)方甘草酸苷片 0.113 12.59±1.76*27.99±1.87**波棱瓜子木脂素 0.375 11.53±1.55**22.43±1.95**0.75 10.94±1.57**20.60±2.29**1.5 12.47±1.77**23.94±3.07**3 11.88±1.29**21.84±3.26**

與空白組比較, 模型組小鼠血清NO含量升高, NOS活力增強(qiáng). 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素各劑量組均能降低免疫性肝損傷小鼠升高的血清NO、NOS水平(p<0.05～0.01). 結(jié)果見(jiàn)表3.

2.5 對(duì)小鼠血清MPO活力的影響

與空白組比較, 模型組小鼠血清中MPO含量顯著升高. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能明顯減輕小鼠血清MPO的含量(p<0.01). 結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清MPO的影響, n=10)Table 4 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of serum MPO of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表4 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清MPO的影響, n=10)Table 4 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of serum MPO of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1MPO/U·L-1空白 219.27±36.22**模型 587.12±71.97聯(lián)苯雙酯 0.2 362.83±90.53**復(fù)方甘草酸苷片 0.113 434.61±63.69**波棱瓜子木脂素 0.375 432.65±67.65**0.75 375.61±87.06**1.5 391.35±66.50**3 358.90±85.50**

表5 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH-Px的影響(,n=10)Table 5 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of MDA, SOD and GSH-Px in liver homogenates of liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表5 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH-Px的影響(,n=10)Table 5 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of MDA, SOD and GSH-Px in liver homogenates of liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1MDA/nmol·mgprot-1SOD/U·mgprot-1GSH-Px/U·mgprot-1空白 - 13.88±1.67**56.48±4.49**979.37±81.70**模型 - 27.01±2.63 45.30±0.71 529.00±40.89聯(lián)苯雙酯 0.2 18.33±2.69**49.97±2.63*730.44±61.91**復(fù)方甘草酸苷片 0.113 21.67±2.07**51.75±4.01**802.84±124.45**波棱瓜子木脂素 0.375 21.58±2.85**53.03±2.64**892.88±103.17**0.75 17.59±1.68**54.27±4.39**989.26±140.89**1.5 18.48±1.66**51.02±2.20**928.99±238.69**3 17.03±2.35**53.29±3.70**961.17±248.44**

2.6 對(duì)小鼠肝勻漿MDA含量及SOD、GSH-Px活力的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝勻漿中MDA含量明顯升高, SOD、GSH-Px活性明顯下降(p<0.01), 表明ConA致免疫性肝損傷小鼠與氧化應(yīng)激有一定的聯(lián)系. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素對(duì)肝組織MDA的含量均有不同程度的降低, SOD、GSH-Px的活性有不同程度的升高(p<0.01), 表現(xiàn)出較好的抗氧化作用. 結(jié)果見(jiàn)表5.

2.7 對(duì)小鼠TNF-α、IFN-γ、NF-κB表達(dá)的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝臟中IFN-γ、TNF-α和NF-κB表達(dá)水平明顯升高(p<0.05). 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能明顯或部分降低小鼠肝組織中IFN-γ、TNF-α和NF-κB的表達(dá)(p<0.05). 結(jié)果見(jiàn)表6和圖2-4.

表6 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致肝損傷小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、NF-κB表達(dá)的影響(±s ,n=10)Table 6 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of TNF-α, IFN-γ and NF-κB in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

表6 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致肝損傷小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、NF-κB表達(dá)的影響(±s ,n=10)Table 6 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of TNF-α, IFN-γ and NF-κB in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1TNF-α IFN-γ NF-κB空白 0.1654±0.0030**0.2506±0.0025*0.1750±0.0079*模型 0.1784±0.0029 0.2572±0.0028 0.1839±0.0053聯(lián)苯雙酯 0.2 0.1665±0.0052*0.2512±0.0038*0.1752±0.0102*復(fù)方甘草酸苷片 0.113 0.1662±0.0045*0.2510±0.0018*0.1750±0.0062*波棱瓜子木脂素 0.375 0.1798±0.0108 0.2565±0.0079 0.1785±0.0049 0.75 0.1762±0.0078 0.2571±0.0043 0.1762±0.0047 1.5 0.1753±0.0026 0.2540±0.0057 0.1860±0.0098 3 0.1665±0.0051*0.2511±0.0049*0.1750±0.0043*

表7 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致肝損傷小鼠肝臟IL-4、IL-10表達(dá)的影響(±s , n=10)Table 7 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of IL-4and IL-10 in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

表7 波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致肝損傷小鼠肝臟IL-4、IL-10表達(dá)的影響(±s , n=10)Table 7 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of IL-4and IL-10 in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

等：川西獐牙菜多糖的提取及含量測(cè)定組別 劑量/g·kg-1IL-4 IL-10空白 - 0.2614±0.0122 0.2596±0.0058**模型 - 0.2799±0.0149 0.2471±0.0021聯(lián)苯雙酯 0.2 0.2618±0.0065 0.2562±0.0076*復(fù)方甘草酸苷片 0.113 0.2752±0.0090 0.2555±0.0068*波棱瓜子木脂素 0.375 0.2713±0.0148 0.2525±0.0099 0.75 0.2735±0.0155 0.2512±0.0056 1.5 0.2547±0.0101 0.2513±0.0065 3 0.2665±0.0295 0.2559±0.0056*

2.8 對(duì)小鼠IL-4、IL-10表達(dá)的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝組織中IL-4表達(dá)水平明顯升高, IL-10表達(dá)水平明顯降低(p<0.01). 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能明顯或部分降低IL-4表達(dá), 升高IL-10表達(dá)(p<0.05), 顯示出一定的抗炎作用. 結(jié)果見(jiàn)表7和圖5-6.

3 討論

肝臟是含酶豐富的臟器, 一旦肝細(xì)胞受損, 其胞漿中所含的各種酶可進(jìn)入血液, 如ALT、AST、ALP等. 通過(guò)檢測(cè)血清中上述酶的活性, 可反映肝細(xì)胞受損情況. 本研究采用ConA致免疫性肝損傷動(dòng)物模型對(duì)波棱瓜子總木脂素進(jìn)行藥效篩選, 結(jié)果表明, 波棱瓜子總木脂素能顯著降低小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、堿性磷酸酶ALP水平, 糾正肝臟系數(shù)的變化, 提示波棱瓜子總木脂素對(duì)ConA致免疫性肝損傷有保護(hù)作用. 病理檢查結(jié)果表明, 波棱瓜子總木脂素能夠改善免疫性肝損傷肝臟組織病理學(xué)變化和肝臟組織炎癥. 其保護(hù)作用可能與阻止肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜通透性改變, 肝細(xì)胞的破損、壞死和程序性死亡有關(guān).

研究表明, 肝臟損傷過(guò)程伴隨著嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng). 其中, NO是體內(nèi)典型的自由基, 充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)、抑制血小扳聚集、介導(dǎo)免疫反應(yīng)等功能, 是體內(nèi)高效的氣體傳遞調(diào)節(jié)遞質(zhì). 免疫性等各種原因?qū)е碌母螕p傷時(shí), 肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞合成NO增多, 活性氧的生成超過(guò)清除, 肝臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài). 實(shí)驗(yàn)顯示, 波棱瓜子總木脂素能顯著降低血清NO含量和抑制與之相關(guān)的NOS的活力, 通過(guò)減弱NO過(guò)度表達(dá)而保護(hù)肝臟. MPO則是氧化應(yīng)激的重要介質(zhì), 能介導(dǎo)炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答, 是中性粒細(xì)胞釋放的重要的過(guò)氧化物酶類, 通過(guò)釋放活性氧和其它毒性物質(zhì)造成組織損傷. ConA經(jīng)尾靜脈注射可使MPO明顯升高, 表明肝臟組織炎癥反應(yīng)十分明顯. 給予波棱瓜子

總木脂素可以降低ConA導(dǎo)致的MPO過(guò)高水平, 減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 起到抗氧化損傷作用. 過(guò)高的自由基還可直接攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)成分, 生成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物. 其中MDA的含量高低與自由基損傷程度密切相關(guān), 能增加細(xì)胞膜通透性, 造成生理功能紊亂, 導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、壞死, 可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度. SOD和GSH-Px是評(píng)定抗氧化水平主要觀察的生物化學(xué)指標(biāo). SOD是體內(nèi)一種非常重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑, 可催化超氧陰離子的歧化反應(yīng), 其活性與清除超氧自由基能力成正相關(guān), 可減輕肝細(xì)胞的損傷, 對(duì)維持體內(nèi)過(guò)氧化物平衡起重要作用. GSH-Px廣泛存在于機(jī)體內(nèi), 是重要的過(guò)氧化物分解酶, 它可以催化脂質(zhì)過(guò)氧化物的還原, 阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng), 起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用[12-17]. 本實(shí)驗(yàn)中ConA損傷肝臟, 導(dǎo)致肝組織中MDA含量異常升高, SOD和GSH-Px活性減弱. 連續(xù)給予波棱瓜子總木脂素7d, 可降低肝組織中MDA含量, 增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性, 說(shuō)明波棱瓜子總木脂素可能通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞膜, 清除自由基, 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)揮其保護(hù)肝臟的作用.

在免疫性肝損傷中, 各種炎癥因子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用. 雖然早期炎癥反應(yīng)有助于宿主清除病原微生物;然而, 過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)于宿主而言是一種極為有害的應(yīng)激反應(yīng). 在本研究所采用的ConA所致肝損傷中, 各類炎癥因子發(fā)揮至關(guān)重要的作用, 而早期肝細(xì)胞損害與細(xì)胞因子作用有關(guān), 在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)前, 即已出現(xiàn)相關(guān)細(xì)胞因子的峰值. TNF-α、IFN-γ是參與該疾病模型最重要的細(xì)胞因子, 亦是是引起急、慢性肝損傷的重要因素之一. TNF-α是一種由活化的T細(xì)胞、NKT細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞分泌的多效促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)物, 能激活T, B淋巴細(xì)胞,增加自然殺傷細(xì)胞的殺傷能力, 也能夠激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 引起各種炎癥因子的釋放, 直接或間接引起肝細(xì)胞的免疫損傷. 干擾素IFN-γ是由Th1細(xì)胞及NK細(xì)胞所分泌的巨噬細(xì)胞激活劑, 能增加巨噬細(xì)胞吞噬能力, 刺激細(xì)胞釋放氧化因子和TNF-α, 誘導(dǎo)Fas激活肝細(xì)胞的程序性死亡[18-25]. NF-κB能誘導(dǎo)與免疫和炎癥有關(guān)的多種細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá), 是炎癥反應(yīng)的上游環(huán)節(jié), 在免疫性肝損傷病理生理過(guò)程中高表達(dá), 控制早期基因表達(dá), 引起下游調(diào)控基因激活, 參與了肝損傷的發(fā)生和發(fā)展, 干預(yù)疾病過(guò)程, 影響機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡過(guò)程[26]. IL-4是NKT細(xì)胞分泌產(chǎn)生, 通過(guò)自分泌進(jìn)一步增加NKT細(xì)胞對(duì)肝臟細(xì)胞的細(xì)胞毒作用. IL-10是免疫抑制劑, 是抗炎性細(xì)胞因子, 對(duì)肝臟具有保護(hù)作用. 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示, 波棱瓜子總木脂素能夠促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá), 抑制IFN-γ、IL-4的過(guò)強(qiáng)表達(dá), 減少TNF-α生成, 抑制NF-κB信號(hào)途徑的激活, 減少后續(xù)炎癥因子的釋放, 減輕肝細(xì)胞的損傷.

綜上所述, 波棱瓜子總木脂素連續(xù)給藥能夠降低ConA所致免疫性肝損傷小鼠血清酶活力升高, 改善肝臟病理?yè)p傷如炎癥、出血及壞死, 對(duì)免疫性肝損傷表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用, 其機(jī)制與抗氧化應(yīng)激、抗炎作用有關(guān).

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The protective effect and its mechanism of total Lignans from Tibetan medicinal Herpetospermum Seeds on Concanavalin A-induced liver injury in mice

GU Jian, LI Jia-chuan, FAN Li-na
(Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:To investigate the protection effect and mechanism of the total Lignans from Tibetan MedicinalHerpetospermumSeeds on immunologic liver injury induced by ConA.Methods:Immunologic liver injury was induced by a single intravenous injection of ConA (20mg/kg). Then animals were sacrificed at the 8h post-injection, blood samples and liver were collected. Subsequently, organ index of liver, and biochemical parameters, such as ALT, AST, ALP, NO, NOS, MPO in serum and SOD, MDA, GSH-Px in liver tissue were evaluated. The pathological changes of the liver tissue were measured by HE staining. Finally, the expressions of TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10, NF-κB were tested with immunohistochemical method.

Herpetospermum seed; Hepatoprotective; concanavalin A; anti-inflammatory; anti-oxidant

圖1 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)影響(HE, ×100)Figure 1 The effects on the histopathologyof immunologic liver injury mice induced by ConA(HE, ×100)

圖2 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響Figure 2 The effects on theTNF-α of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖3 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織干擾素-γ(IFN-γ)的影響Figure 3 The effects on the liverIFN-γ of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖4 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的影響Figure 4 The effects on the liver NF-κB of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖5 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織白介素4(Il-4)的影響Figure 5 The effects on the liverIL-4 of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖6 對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織白介素10(Il-10)的影響Figure 6 The effects on the liverIL-10 of immunologic liver injury mice induced by ConA

R28; R29

: A

: 1003-4271(2014)03-0375-13

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.10

2014-04-04

顧健(1967-), 男, 漢族, 浙江武義人, 教授, 博士, 研究生導(dǎo)師, 研究方向: 民族藥物及中藥研究與開(kāi)發(fā). E-mail：gujiancd@163.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金(81674168）; 四川省科學(xué)技術(shù)廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011 FZ0053); 四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2012JY0027）資助.

Results:The total Lignans could reduce serum activities of ALT, AST, ALP, NOS, MPO and serum levels of NO. Meanwhile, lower serum levels of MDA and elevated activities of SOD and GSH-Px were observed in total Lignans treated liver injury mice. Furthermore, total Lignans significantly reduced the expressions of TNF-α, IFN-γ, IL-4 and NF-κB, and increased the expressions of IL-10. Pathological results also showed that the total Lignans could attenuate ConA-induced liver damage.Conclusion:The total Lignans from Tibetan MedicinalHerpetospermumSeeds have a certain Hepatoprotective effect on ConA-induced immunological liver injury in mice, which may be related its anti-oxidant and anti-inflammatory effects.