陳土娟，黃子娟，潘海玉，陳佳敏，王 瓊，郭克婷，潘春香

茴香成熟葉柄石蠟切片技術(shù)的研究

陳土娟，黃子娟，潘海玉，陳佳敏，王 瓊，郭克婷，潘春香*

（韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

石蠟切片技術(shù)是一項(xiàng)基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在具體操作過程中仍經(jīng)常在的裂紋、皺縮、不粘片、脫落、薄厚不勻等問題.且不同作物，同一種作物不同器官，同一器官不同發(fā)育階段，每一環(huán)節(jié)所采取的方法不同，在實(shí)際操作工程中均不能照搬實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)或者文獻(xiàn)，而需要進(jìn)行反復(fù)摸索才可以制得一個(gè)理想的片子.實(shí)驗(yàn)以小茴香成熟葉柄為材料，通過大量的摸索性試驗(yàn)，成功制得了小茴香成熟葉柄的永久性石蠟片子，明確了葉柄的內(nèi)部組織構(gòu)造，提出了取材與固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、染色、切片、粘片等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的適宜操作方法，提高了制片效率和成功率，為利用石蠟切片技術(shù)進(jìn)行科研和教學(xué)的工作人員提供參考.

茴香；成熟葉柄；石蠟切片

石蠟切片技術(shù)因其具有經(jīng)濟(jì)、方便、適用、簡便、易操作、設(shè)備要求不高、可長期保存等優(yōu)點(diǎn)而在組織學(xué)和病理學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中成為最為廣泛的應(yīng)用.它在植物的科學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域扮演著十分重要的角色.但是，在石蠟切片制作仍然存在切片不成帶、彎曲、出現(xiàn)裂紋、皺縮、不粘片、脫落、薄厚不勻等諸多問題，且不同作物，同一種作物不同器官，同一器官不同發(fā)育階段，每一環(huán)節(jié)所采取的方法不同，在實(shí)際操作工程中均不能照搬實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)或者文獻(xiàn)，而需要進(jìn)行反復(fù)摸索才可以制得一個(gè)理想的片子.因此，針對石蠟存在的問題，有過很多探討和改良.有針對不同植物的研究，如玉米成熟期莖稈［1］、水稻籽粒胚乳［2］、大豆莖頂端分生組織［3］、蕨類植物［4］、白頭翁花［5］、杏花芽［6］、樺樹松蘿［7］、粳稻穎果［8］、含羞草［9］等.也有針對石蠟切片技術(shù)改良進(jìn)行研究的，如候春春經(jīng)過總結(jié)和自己實(shí)踐提出了試驗(yàn)藥劑、時(shí)間和溫度是三大關(guān)鍵因素［10］；楊捷頻提出了一些能縮短實(shí)驗(yàn)周期，解決實(shí)驗(yàn)有毒物質(zhì)二甲苯污染的方案［11］；從載玻片、蓋玻片的處理，浸蠟與包埋，染色液的配制，展片、粘片、烘片進(jìn)行了探索，提出了染色效果好、組織不脫落的關(guān)鍵技術(shù)［12］；江虹針對切片不成帶、切片彎曲、切片裂紋、厚薄不勻、皺縮、粘刀、脫落、灰染、著色不勻、褪色、封固不良等問題進(jìn)行了探索，并提出了解決措施［13］；趙俊對石蠟的精煉、取材與固定、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、展片、粘片、脫蠟復(fù)水及染色、中性樹膠封藏幾個(gè)方面探討了植物石蠟切片技術(shù)［14］.本文以內(nèi)蒙古小茴香葉柄為材料，對其石蠟切片技術(shù)的取材、固定、洗滌、脫水、包埋、切片、粘片、脫蠟、染色、脫水、透明和封膠等一系列環(huán)節(jié)進(jìn)行了試驗(yàn)和總結(jié)，提出了取材與固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、染色、切片、粘片等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的適宜方法，以提高制片效率和成功率，為石蠟切片技術(shù)在植物解剖學(xué)上的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

選擇內(nèi)蒙古小茴香葉柄為材料，切成大約長度3～5 mm莖段，立即放入FAA固定液中固定，抽氣后放置4℃冰箱貯存.

1.2 試驗(yàn)方法

小茴香于2013年3月播種于韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院C座樓頂大棚花盆中，取成熟的葉柄作為材料.切片在韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的石蠟包埋技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)小茴香成熟葉柄的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對脫水、透明、透蠟、包埋、染色、切片、粘片、脫蠟、封片等步驟進(jìn)行了改進(jìn).實(shí)驗(yàn)用德國徠卡半薄切片機(jī)切片，德國萊卡LEICA DM LS2顯微鏡觀察，Nikon COOLPIX4500數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微成像.

（1）取材與固定：材料在低溫的條件下(保溫材料的盒子里面裝冰塊)取，且迅速固定.分割材料要快、準(zhǔn)，分割長度為3～5 mm.固定用醫(yī)用青霉素小瓶，每個(gè)小瓶中放置3～4段材料，固定24 h.

（2）脫水與透明：脫水與透明，時(shí)間是關(guān)鍵，而且脫水與透明二者密切相關(guān).脫水越充分，透明所需的時(shí)間就越短.實(shí)驗(yàn)采取脫水透明均為1.5 h.

（3）染色：染色在1/2純酒精+1/2純二甲苯透明時(shí)間加入效果最好.染色劑量以1～2滴為宜.

（4）包埋：石蠟選擇與精煉石蠟質(zhì)地是石蠟切片中最為關(guān)鍵的一步.以54～56，熔點(diǎn)53～57規(guī)格的石蠟包埋效果好.煮蠟用75℃恒溫水浴進(jìn)行多次熔蠟換杯.豎立材料包埋中豎立材料的過程也是比較難的一步.采用制冷臺方法.具體為：先將兩條玻璃（當(dāng)成致冷臺）放到?jīng)鏊薪鰝溆茫缓髮⑾灡械慕M織與蠟液全部倒入紙船，擺好材料的位置，再將紙船放到浸過涼水的玻璃塊上，迅速將已經(jīng)擺好的材料豎立起來.

（5）切片、粘片與脫蠟：夏天高溫季節(jié)切片之前，先將蠟塊放入冰箱中冰凍一會，保持石蠟的硬度；當(dāng)室內(nèi)干燥時(shí)，在旁邊放一盆溫水增加室內(nèi)濕度.粘片采用撈片法.即：將切好的片子放到40℃左右的溫水上，使切片展開，然后用載玻片將蠟片撈起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.撈片法會帶有許多水分，一般需要烘1 h以上或更長時(shí)間.脫蠟的時(shí)間長短與氣溫有關(guān).夏天高溫時(shí)，時(shí)間可以短一點(diǎn)，每一步驟3～5 min；冬季低溫時(shí)，可延長時(shí)間，或提高室溫.

（6）溶液換置與封片：脫蠟、染色、脫水透明過程所用的溶液在重復(fù)用過3～4遍后，要更換溶液.通常二甲苯里進(jìn)入水分后，二甲苯溶液會出現(xiàn)白色渾濁或水珠狀的懸浮物，因此，二甲苯溶液需要更換.封片要濕封.即先將膠液滴在組織的邊緣位置，然后將蓋玻片傾斜蓋在膠液上，再緩慢將膠液輕輕壓至組織上，讓其自然風(fēng)干.

2 結(jié)果與分析

2.1茴香葉柄石蠟包埋制片方法

針對茴香葉柄結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及石蠟包埋制片方法中存在的問題，通過大量摸索性試驗(yàn)，得到了適合茴香成熟葉柄的石蠟切片方法，同傳統(tǒng)石蠟切片法相比，在固定、石蠟選擇、石蠟精煉、脫水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脫蠟、封片等方面進(jìn)行了改進(jìn)，提高了制片效率.

（1）脫水與透明.明確了脫水時(shí)間與透明時(shí)間的相關(guān)性，即脫水時(shí)間越長，透明時(shí)間就越短，本實(shí)驗(yàn)脫水2 h，透明為1.5 h.

（2）染色.傳統(tǒng)染色方法是在70%酒精脫水時(shí)加入染色劑.但實(shí)際操作過程中，即使是放置一個(gè)晚上，已染色的材料也會在后續(xù)逐級高濃度的酒精中被沖洗掉，最后幾乎全部脫色.本實(shí)驗(yàn)摸索出在1/2純酒精+ 1/2純二甲苯透明時(shí)間加入染色劑效果最好.

（3）石蠟選擇與精煉.實(shí)驗(yàn)對比了規(guī)格52～54，熔點(diǎn)51～55和規(guī)格54～56，熔點(diǎn)53～57兩種石蠟的包埋效果，篩選出規(guī)格54～56，熔點(diǎn)53～57規(guī)格的效果較好.煮蠟用75℃恒溫水浴進(jìn)行多次熔蠟換杯為宜.

（4）豎立材料.豎立材料使石蠟切片中難以操作的一步.通常采用冷水中放置紙船的方法，但在實(shí)際操作過程中存在難以豎立、組織與石蠟分離等現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)采用的制冷臺方法，效果很好.

（5）切片、粘片和脫蠟切片與室內(nèi)溫度密切相關(guān).夏天操作時(shí)容易出現(xiàn)組織壓縮，切片皺褶不易展開之現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)摸索出夏天高溫季節(jié)切片之前，先將蠟塊放入冰箱中冰凍一會，保持石蠟的硬度；同時(shí)，當(dāng)夏季室內(nèi)干燥，蠟片受靜電影響卷片，不能形成連片時(shí)，在旁邊放一盆溫水增加室內(nèi)濕度可一切出較好的片子.傳統(tǒng)方法是用加熱展開的方法，即在粘片時(shí)，滴一滴蒸餾水在載玻片上，再取切片，浮置水面上，然后置烘片臺上，使切片展開燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度.最后將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時(shí)以記號筆在玻片上編號，放入30～40℃溫箱中約24 h烘干.

本研究的改良方法為撈片法，即用將切好的片子放到40℃左右的溫水上，使切片展開，然后用載玻片將蠟片撈起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.撈片法會帶有許多水分，一般需要烘1 h以上或更長時(shí)間.脫蠟的時(shí)間長短與氣溫有關(guān).夏天高溫時(shí)，時(shí)間可以短一點(diǎn)，每一步驟3～5 min；氣溫較低的冬天時(shí)，要延長時(shí)間，甚至提高室溫，否則蠟不容易被脫去，從而影響后續(xù)的步驟.

（6）溶液換置和封片.一般脫蠟、染色、脫水透明過程所用的溶液在重復(fù)用過3～4遍后，就要更換溶液.如果有水分進(jìn)入二甲苯，二甲苯溶液就會出現(xiàn)白色渾濁甚至出現(xiàn)水珠狀的懸浮物質(zhì)，經(jīng)過染色的載玻片逐級放入其他溶液缸中的時(shí)候，也會導(dǎo)致其他缸中的溶液變色.一般，觀察其顏色變化的深淺來斷定是否該換其溶液.

通常封片前切片在空氣中放置時(shí)間太長，二甲苯揮發(fā)，不僅使封片劑難以進(jìn)入組織間隙，而且切片中易出現(xiàn)類似色素樣的點(diǎn)狀結(jié)晶和像核一樣的黑色圓斑.封片用的是中性樹膠.我們摸索出的方法為：濕封.即先將膠液滴在組織的邊緣位置，然后將清洗干凈的蓋玻片的傾斜蓋在膠液上，再緩慢地將膠液輕輕壓至組織上，最好選用稀一點(diǎn)的膠液.封好片貼上標(biāo)簽，讓其自然風(fēng)干.

2.2小茴香葉柄石蠟包埋制片效果

小茴香葉柄的石蠟包埋切片組織完整、清晰、染色均勻，如圖1所示.葉柄是葉片與莖的連接部分，主要起輸導(dǎo)和支持作用.葉柄具有與莖相連的維管束，是葉片與莖之間的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?葉柄由外到內(nèi)由表皮、厚壁細(xì)胞、皮層、維管束、髓腔組成.表皮細(xì)胞近似長方形，排列緊密.厚壁細(xì)胞是具有由初生壁和次生壁組成的細(xì)胞.維管束形成中可見初生韌皮部，初生木質(zhì)部，初生木質(zhì)部10束，呈發(fā)散型分布.初生木質(zhì)部的外面是初生韌皮部.葉柄中間髓部為空腔，被周圍薄壁細(xì)胞圍繞，沿著維管束延伸，形成葉柄內(nèi)的氣道.

圖1 小茴香葉柄橫切面圖

3 討論

關(guān)于小茴香植物組織構(gòu)造方面的研究報(bào)道較少.潘春香等研究了內(nèi)蒙古茴香與“油茴1號”茴香根、莖的解剖結(jié)構(gòu)，該研究重點(diǎn)揭示了2個(gè)品種根、莖的基本組織結(jié)構(gòu)及其區(qū)別，而未總結(jié)和提出其相關(guān)的石蠟包埋技術(shù)的具體改進(jìn)［15］.本實(shí)驗(yàn)在對葉柄基本組織構(gòu)造進(jìn)行觀察的同時(shí)，重點(diǎn)研究總結(jié)了成熟葉柄的石蠟包埋技術(shù).

小茴香葉柄由外到內(nèi)由表皮、厚壁細(xì)胞、皮層、維管束、髓腔組成.表皮細(xì)胞近似長方形，排列緊密.厚壁細(xì)胞是具有由初生壁和次生壁組成的細(xì)胞.維管束由初生韌皮部和初生木質(zhì)部組成，有10束，呈發(fā)散型分布.初生木質(zhì)部的外面是初生韌皮部.葉柄中間髓部為空腔，被周圍薄壁細(xì)胞圍繞，沿著維管束延伸，形成葉柄內(nèi)的氣道.外層細(xì)胞排列致密、木質(zhì)化程度高、內(nèi)部細(xì)胞疏松、組織較軟.針對成熟期小茴香成熟葉柄的結(jié)構(gòu)特性，在傳統(tǒng)石蠟包埋的基礎(chǔ)上，在固定、石蠟選擇、石蠟精煉、脫水、透明、染色、包埋、切片、粘片、脫蠟、封片等方面進(jìn)行了改進(jìn)，提高了制片效率.

具體改進(jìn)方法為：脫水2 h、透明1.5 h；染色是在1/2純酒精+1/2純二甲苯透明時(shí)間加入染色劑；石蠟選擇規(guī)格為54～56，熔點(diǎn)53～57的；煮蠟用75℃恒溫水浴進(jìn)行多次熔蠟換杯為宜；豎立材料制冷臺方法，即先將兩條玻璃（當(dāng)成致冷臺）放到?jīng)鏊薪鰝溆?，然后將蠟杯中的組織與蠟液全部倒入紙船，擺好材料的位置，再將紙船放到浸過涼水的玻璃塊上，迅速將已經(jīng)擺好的材料豎立起來；切片在夏天高溫季節(jié)切片之前，先將蠟塊放入冰箱中冰凍一會，保持石蠟的硬度；同時(shí)，當(dāng)室內(nèi)干燥時(shí)，在旁邊放一盆溫水增加室內(nèi)濕度；粘片為撈片法，即用將切好的片子放到40℃左右的溫水上，使切片展開，然后用載玻片將蠟片撈起，并吸掉多余的水分，放到40℃烘箱中烘干.撈片法會帶有許多水分，一般需要烘1 h以上或更長時(shí)間；脫蠟的時(shí)間長短與氣溫有關(guān).夏天高溫時(shí)，時(shí)間可以短一點(diǎn)，每一步驟3～5 min；氣溫較低的冬天時(shí)，要延長時(shí)間，甚至提高室溫，否則蠟不容易被脫去，從而影響后續(xù)的步驟；溶液換置一般脫蠟、染色、脫水透明過程所用的溶液在重復(fù)用過3～4遍后，就要更換溶液.如果有水分進(jìn)入二甲苯，二甲苯溶液就會出現(xiàn)白色渾濁甚至出現(xiàn)水珠狀的懸浮物質(zhì)，經(jīng)過染色的載玻片逐級放入其他溶液缸中的時(shí)候，也會導(dǎo)致其他缸中的溶液變色.一般，觀察其顏色變化的深淺來斷定是否該換其溶液；封片為濕封.即先將膠液滴在組織的邊緣位置，然后將清洗干凈的蓋玻片的傾斜蓋在膠液上，再緩慢地將膠液輕輕壓至組織上，最好選用稀一點(diǎn)的膠液.封好片貼上標(biāo)簽，讓其自然風(fēng)干.

石蠟切片技術(shù)簡單易行，但要想切出一個(gè)好的片子卻絕非易事，需要針對具體材料、藥劑、設(shè)備、操作環(huán)境等情況進(jìn)行長時(shí)間的摸索和總結(jié).希望本研究能為石蠟切片技術(shù)操作者提供參考.

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Research on plant paraffin section technology on mature petioles of fennel

CHEN Tu-juan，HUANG Zi-juan，PAN Hai-yu，CHEN Jia-min，WANG Qong，GUO Ke-ting，PAN Chun-xiang*
(Yingdong College of Agricultural Science and Engineering,Shaoguan University，Shaoguan 512005,Guangdong，China)

Paraffin section technology is the most basic experimental technology，but problems of cracking，shrinking，non-sticking to slides，exfoliation and uneven thickness still exist in the process of operation. Meanwhile，the methods are differently used on different plants，different organs of same plant and different growth stage of same organ，so it is unreasonable to copy the methods listed in experiment guidance or reference.An ideal slide only can be obtained through trial and error.This experiment applies the mature petioles of fennel as experimental material，and through this experiment it successfully obtain the permanent paraffin slide of fennel’s mature petioles through trial and error and make clear the internal organizations and structures of the petioles.Additionally，it also figured out some appropriate operating methods in some key procedures，such as sampling and fix，dehydration and verification，paraffin and embedding，staining，section，sticking and so on.These methods effectively improve the efficiency of making slides and provide references for staff to do scientific research and teach by making use of the paraffin section technology.

fennel;mature petioles;paraffin section

G945.79

A

1007-5348（2014）12-0041-05

（責(zé)任編輯：邵曉軍）

2014-05-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070287）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃建設(shè)項(xiàng)目（201310576-003）.

陳土娟（1989-），女，廣東湛江人，韶關(guān)學(xué)院英東農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院學(xué)生，主要從事芳香植物栽培與生理方面的研究.*通訊作者.