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        鹽度脅迫下口蝦蛄Mn-SOD 基因的表達(dá)分析

        2014-02-15 08:01:12劉海映張紅陳雷邢坤于曉明田燚
        關(guān)鍵詞:蝦蛄鹽度引物

        劉海映,張紅,陳雷,邢坤,于曉明,田燚

        (1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連116023;2.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連116023)

        超氧化物歧化酶(SOD)是McCord等[1]從牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并正式命名的,是各種生物體內(nèi)重要的抗氧化酶類。根據(jù)與其結(jié)合的金屬離子不同,SOD可分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-SOD。SOD 能消除體內(nèi)的氧自由基,可對(duì)抗和阻斷氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害,并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞[2]。水生生物在逆境脅迫(如重金屬、污染、強(qiáng)光、離子輻射、極端溫度、水分脅迫、鹽度脅迫等)下,生物體內(nèi)的SOD 酶在防御外來壓力、消除過量的O-2·、維持生物體內(nèi)活性氧分子的代謝平衡和保護(hù)機(jī)體免受活性氧損傷等方面起著重要的作用[3-5]。因此,研究水生生物體內(nèi)SOD 酶的表達(dá)量對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖、疾病防治、生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面具有重要意義。李華等[6]、葉建生等[7]研究表明,鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清中SOD 酶活力影響顯著。

        口蝦蛄Oratosquilla oratoria 隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、口足目、蝦蛄科、口蝦蛄屬,常棲息于泥沙底質(zhì),在中國沿海均有分布??谖r蛄味道鮮美、營養(yǎng)豐富,是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的水產(chǎn)品。目前,對(duì)口蝦蛄的研究主要集中在生物學(xué)基礎(chǔ)特征、群體結(jié)構(gòu)、提取物的醫(yī)藥作用等方面[8-13]。劉海映等[14]研究了鹽度對(duì)口蝦蛄生長和存活的影響,指出大連沿海口蝦蛄的生存鹽度為20 ~40,最適鹽度為24 ~36。培育口蝦蛄Z9 ~Z11 期假溞狀幼體的適宜鹽度為27 ~33[15]。目前,有關(guān)在鹽度脅迫下,口蝦蛄功能基因表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。本研究中,采用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)了口蝦蛄在不同鹽度脅迫和不同脅迫時(shí)間下,Mn-SOD 基因的表達(dá)情況,旨在為口蝦蛄的育苗工作提供參考,同時(shí)也為研究口蝦蛄對(duì)鹽度的調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)用口蝦蛄取自遼寧盤錦光合蟹業(yè)水產(chǎn)有限公司,為土池育苗的Z9 ~Z11 期口蝦蛄。

        試劑和引物主要有:動(dòng)物總RNA 提取試劑盒(天根生物科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量相關(guān)試劑(寶生物公司);PCR 引物(大連萬澤貿(mào)易有限公司)、DL2000Marker(生工生物公司)、dNTP、Hotstart DNA Polymerase(生工生物公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)置8 組,鹽度分別為12.8、16.3、19.8、23.3、26.8、30.3、33.8、37.3(26.8 為海水鹽度,設(shè)為對(duì)照組),每個(gè)鹽度組約放100 只口蝦蛄。于鹽度脅迫后的1.5、3、6、9、12、24、36、48、72 h,分別從每個(gè)鹽度組取8 只口蝦蛄,浸泡于RNA 液中,于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 從每個(gè)脅迫鹽度組的各個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)采集的樣品中隨機(jī)取兩只口蝦蛄,按試劑盒說明書步驟提取總RNA。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的質(zhì)量,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度。使用PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:1 μL 總RNA、2 μL 5×PrimeScript buffer(for Real Time)、0.5 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、0.5 μL 1×OligodT Primer(50 μmol/L)、0.5 μL 1×Random 6 mers(100 μmol/L),用RNase-free 水定容至10 μL。反應(yīng)在PCR 儀上進(jìn)行,先于37 ℃下反應(yīng)15 min,再于85 ℃下反應(yīng)5 s。

        1.2.3 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室克隆得到的Mn-SOD 基因全長,用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物(表1),用β-actin 作為定量表達(dá)內(nèi)參基因[16]。將引物進(jìn)行PCR 檢測(cè),篩選出條帶單一、無二聚體的引物,用于下一步的試驗(yàn)。

        表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

        反應(yīng)體系為:1 μL cDNA、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、2 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、0.2 μL Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、18.30 μL 滅菌蒸餾水。Mn-SOD 反應(yīng)條件:94 ℃下預(yù)變性4 min;94 ℃下變性30 s,退火1 min,退火溫度分別為54、55、56、57、58、59 ℃,72 ℃下延伸5 min,共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min,于4 ℃下保溫。β-actin 的反應(yīng)條件同上,退火溫度分別為66、67、68、69、70、71 ℃。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),條帶最亮?xí)r的溫度即為最佳退火溫度。

        1.2.4 Mn-SOD 基因的定量表達(dá)分析 利用引物SOD-F和SOD-R 對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增,用β-actin-F和β-actin-R 作為內(nèi)參引物。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性30 s,57 ℃下退火30 s,72 ℃下延伸60 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸5 min,于4 ℃下保溫。對(duì)于任意一個(gè)樣品,目標(biāo)基因(Mn-SOD)和內(nèi)參基因(β-actin)擴(kuò)增時(shí)加入等量的模板。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)平行,試驗(yàn)過程重復(fù)3次,利用2-ΔΔCt法分析其定量表達(dá)結(jié)果。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        采用ABI Real-Time 軟件進(jìn)行分析。Mn-SOD基因表達(dá)的相對(duì)濃度計(jì)算公式為

        其中:Ct 為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);CtA、CtB分別為目的基因、參照基因的Ct 值;ExA、ExB分別為目的基因、參照基因的擴(kuò)增效率。

        基因表達(dá)量結(jié)果用SPSS 軟件進(jìn)行顯著性分析,顯著性水平設(shè)為0.05,極顯著水平設(shè)為0.01。

        2 結(jié)果

        2.1 口蝦蛄的總RNA

        從口蝦蛄肌肉組織中提取總RNA,在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行RNA 濃度測(cè)定和質(zhì)量檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)樣品RNA 的OD260nm/OD280nm值為1.9 ~2.1。利用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見圖1,獲得的總RNA 質(zhì)量較高,可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        圖1 口蝦蛄總RNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoretogram of mantis shrimp Oratosquilla oratoria

        2.2 引物和內(nèi)參引物擴(kuò)增的最佳退火溫度

        用RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板,利用已設(shè)計(jì)好的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,所得目的片段電泳結(jié)果如圖2所示。根據(jù)條帶亮度,得到引物β-actin 的最佳退火溫度是68 ℃,引物SOD 的最佳退火溫度為57 ℃。

        圖2 退火溫度篩選的引物擴(kuò)增圖Fig.2 The amplification bands of the primers in gradient annealing temperature

        2.3 口蝦蛄肌肉組織中Mn-SOD 基因的表達(dá)

        2.3.1 不同鹽度脅迫對(duì)Mn-SOD 基因表達(dá)的影響不同鹽度脅迫對(duì)口蝦蛄Mn-SOD 基因表達(dá)的影響顯著。從表2可見:在相同脅迫時(shí)間下,各鹽度組口蝦蛄Mn-SOD 基因的表達(dá)量均與對(duì)照組有顯著或極顯著性差異(P<0.05 或P<0.01);在脅迫時(shí)間為12 h 內(nèi),除鹽度16.3 組脅迫12 h、鹽度19.8 組脅迫1.5 h和3 h、鹽度23.3 組脅迫1.5 h、鹽度30.3 組脅迫9 h 外,其余各試驗(yàn)組Mn-SOD基因的表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01);當(dāng)脅迫時(shí)間為24、36 h 時(shí),除兩個(gè)低鹽度12.8和16.3 組以及鹽度19.8 組脅迫36 h、鹽度37.3 組脅迫36 h 外,其余各試驗(yàn)組Mn-SOD 基因的表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01),在這個(gè)時(shí)間段中,與對(duì)照組鹽度差值小的23.3、30.3 鹽度組,Mn-SOD 基因的表達(dá)量均較高,其中鹽度23.3 組在脅迫時(shí)間為24、36 h 時(shí)的Mn-SOD 基因表達(dá)量分別為對(duì)照組的9.08 倍和1.97 倍;當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)到48、72 h 時(shí),除極低鹽度(12.8)和極高鹽度(37.3)組以及鹽度30.3 組脅迫72 h 外,其余各試驗(yàn)組Mn-SOD 基因的表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

        2.3.2 不同脅迫時(shí)間對(duì)Mn-SOD 基因表達(dá)的影響不同脅迫時(shí)間對(duì)口蝦蛄Mn-SOD 基因表達(dá)的影響顯著。從表2可見:除極高和極低鹽度組外,其余鹽度組Mn-SOD 基因的表達(dá)量均隨著脅迫時(shí)間的延長總體上呈先降低再升高再逐步降低的變化趨勢(shì);鹽度為19.8、23.3、30.3、33.8 時(shí),Mn-SOD基因最大表達(dá)量的時(shí)間點(diǎn)均為24 h,此時(shí)4 個(gè)鹽度組的Mn-SOD 基因表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.82、9.08、4.84、3.41 倍;鹽度為16.3 時(shí),不同脅迫時(shí)間對(duì)Mn-SOD 基因表達(dá)有極顯著性影響(P<0.01),并在12 h 時(shí)Mn-SOD 基因表達(dá)量最大,為對(duì)照組的2.85 倍;鹽度為37.3 時(shí),Mn-SOD 基因表達(dá)量在24 h 時(shí)最大,為對(duì)照組的2.75 倍,而在其他脅迫時(shí)間點(diǎn)Mn-SOD 基因表達(dá)量均很低。

        表2 不同鹽度脅迫、相同處理時(shí)間下Mn-SOD 基因的表達(dá)情況Tab.2 The Mn-SOD gene expression in mantis shrimp under different salinity stress

        3 討論

        鹽度是影響水產(chǎn)動(dòng)物存活和生理反應(yīng)的重要因素之一,直接影響生物的新陳代謝。研究表明,鹽度對(duì)水生生物的呼吸、體質(zhì)量、滲透壓及其組織器官的功能等均有影響[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,鹽度對(duì)口蝦蛄體內(nèi)Mn-SOD 基因表達(dá)量有顯著影響,尤其在極高鹽度37.3和低鹽度12.8、16.3 脅迫下,Mn-SOD 基因表達(dá)量總體上均極顯著低于對(duì)照組。這是由于試驗(yàn)所用Z9 ~Z11 期口蝦蛄的培養(yǎng)鹽度為26.8,而極高和極低鹽度與試驗(yàn)口蝦蛄的培養(yǎng)鹽度相差太大,鹽度脅迫可能造成了口蝦蛄生理機(jī)理紊亂、酶活性降低,從而導(dǎo)致Mn-SOD 基因表達(dá)量降低。在脅迫時(shí)間為1.5 h 時(shí),各鹽度組口蝦蛄處于對(duì)周圍鹽度不適應(yīng)階段,相對(duì)于高鹽度,低鹽度對(duì)Mn-SOD 基因表達(dá)量稍有促進(jìn)作用。在脅迫時(shí)間為3、6 h 時(shí),各鹽度組的Mn-SOD 基因表達(dá)量均低于對(duì)照值(除鹽度19.8 組脅迫3 h外),推測(cè)此階段口蝦蛄對(duì)鹽度表現(xiàn)為極不適應(yīng)狀態(tài),所以基因表達(dá)量都很低。在脅迫時(shí)間為9、12 h 時(shí),各鹽度組Mn-SOD 基因表達(dá)量有所增加,在對(duì)照值或上或下有一個(gè)高峰,這時(shí)的口蝦蛄正在逐漸適應(yīng)周圍的環(huán)境。在脅迫時(shí)間為24、36 h 時(shí),各鹽度組Mn-SOD 基因表達(dá)量在對(duì)照值上、下兩側(cè)各有一個(gè)高峰,且稍高、稍低的鹽度變化均能刺激Mn-SOD 基因的表達(dá)變化,此時(shí)的口蝦蛄對(duì)周圍環(huán)境已經(jīng)適應(yīng),對(duì)外界鹽度脅迫已做出反應(yīng)。根據(jù)王瑞旋等[18]的研究,此時(shí)呼吸量的增加用于排出多余的鹽分或多余的水分來調(diào)節(jié)滲透壓,在這種滲透壓主動(dòng)調(diào)節(jié)過程中,還涉及到皮膚、腸道和腎臟等器官的參與,這時(shí)需要更多的SOD 酶來減少氧自由基對(duì)機(jī)體造成的損害。在脅迫時(shí)間為48、72 h 時(shí),各鹽度組Mn-SOD 基因的表達(dá)量又降低,均極顯著低于對(duì)照值(除鹽度30.3 組脅迫72 h外),說明此時(shí)的口蝦蛄受鹽度脅迫時(shí)間較長,機(jī)體已受到損害,較高和較低的鹽度均不能刺激SOD 酶的增加,這時(shí)的口蝦蛄已不能再適應(yīng)周圍的環(huán)境。

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,鹽度脅迫時(shí)間對(duì)口蝦蛄體內(nèi)Mn-SOD 基因表達(dá)量也有顯著影響。除極高和極低鹽度組外,其余鹽度組Mn-SOD 基因的表達(dá)量均隨著脅迫時(shí)間的延長總體上呈先降低再升高再逐步降低的變化趨勢(shì);各試驗(yàn)鹽度組口蝦蛄在72 h 內(nèi)對(duì)鹽度脅迫的適應(yīng)總趨勢(shì)為不適應(yīng)—最不適應(yīng)—逐步適應(yīng)—不適應(yīng);設(shè)置鹽度與對(duì)照組差值小的組(23.3、30.3 鹽度組),在各個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)其Mn-SOD 基因表達(dá)量總體上高于極高和極低鹽度組。李華等[6]研究表明,凡納濱對(duì)蝦的SOD 酶等免疫生理指標(biāo)呈先波動(dòng)后穩(wěn)定趨勢(shì)。葉建生等[7]研究表明,鹽度突變組SOD 酶活性呈隨時(shí)間延長先降低后升高的變化趨勢(shì),且鹽度突變值越大,SOD酶活性越小。李庭古[19]也指出,鹽度對(duì)蝦蟹類動(dòng)物的影響主要是滲透壓的作用,可以通過改變自身的代謝狀況來適應(yīng)不同的鹽度環(huán)境。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相近。

        水生生物的整個(gè)生長過程都受其水環(huán)境中鹽度的影響。自然條件下,水環(huán)境中的鹽度表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性和晝夜波動(dòng)。此外,養(yǎng)殖生產(chǎn)中定期的換水、偶爾的降雨也會(huì)導(dǎo)致鹽度的突然變化,這種急性鹽度脅迫對(duì)水生生物存活的影響是巨大的。此外,當(dāng)生物體受到其他環(huán)境脅迫時(shí),自由基的量會(huì)增加,要么需要更多的SOD 酶減輕毒性、維持機(jī)體氧化和抗氧化平衡,要么水生生物體不適應(yīng)環(huán)境脅迫而使機(jī)體機(jī)能喪失、SOD 酶的含量降低。不僅水中的總氨氮和亞硝酸鹽氮含量會(huì)影響水生生物的SOD 免疫酶指標(biāo),而且水的鹽度對(duì)水生生物SOD 酶表達(dá)量也有很大影響,因而水生生物體內(nèi)SOD 酶的含量也是水質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步了解口蝦蛄生理生態(tài)學(xué)特征提供資料,并為其養(yǎng)殖生產(chǎn)中的水質(zhì)調(diào)控、疾病預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

        [1]McCord J M,F(xiàn)ridovich I.Superoxide dismutase:an enzymatic function for erythroeuprein(hemocuprein)[J].J Biol Chem,1969,244(22):6049-6055.

        [2]周霞.超氧化物歧化酶的功能和應(yīng)用研究[J].中國中醫(yī)藥咨訊,2011,3(6):318.

        [3]孫娜,王宇佳,柳郁濱,等.Hg2+對(duì)水絲蚓的急性毒性及超氧化物歧化酶活性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(17):143-146.

        [4]吳一挺,王志錚,楊磊,等.pH 對(duì)日本沼蝦耗氧率及鰓組織CAT、SOD 活力的影響[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,30(6):503-506,519.

        [5]趙艷民,王新華,秦延文,等.Hg2+對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺抗氧化酶和脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,44(5):88-95.

        [6]李華,李強(qiáng),曲健風(fēng),等.不同鹽度下凡納濱對(duì)蝦血淋巴免疫生理指標(biāo)比較[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,37(6):927-930.

        [7]葉建生,王興強(qiáng),馬甡,等.鹽度突變對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫因子的影響[J].海洋水產(chǎn)研究,2008,29(1):38-43.

        [8]王春琳,梅文驤.口蝦蛄的生物學(xué)基本特征[J].浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,29(1):38-43.

        [9]劉海映,王桂娥,王秀利.大連海域口蝦蛄資源遺傳多樣性的分析[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(4):350-353.

        [10]林月嬌,劉海映,徐海龍,等.大連近??谖r蛄形態(tài)參數(shù)關(guān)系的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,23(3):215-217.

        [11]顧帝水,孔霞,陳錦,等.口蝦蛄提取物對(duì)體外人鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,21(2):360-361.

        [12]張代臻,丁鴿,張華彬,等.渤海灣葫蘆島海域口蝦蛄mtCOI基因序列多態(tài)性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(3):55-57.

        [13]劉海映,秦玉雪,姜玉聲,等.口蝦蛄胚胎發(fā)育的研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2011,26(5):437- 441.

        [14]劉海映,徐海龍,林月嬌.鹽度對(duì)口蝦蛄存活和生長的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(2):180-183.

        [15]劉海映,王冬雪,姜玉聲,等.鹽度對(duì)口蝦蛄假溞狀幼體存活和攝食的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(4):311-314.

        [16]Kodama K,Rahman M S,Horiguchi T,et al.Assessment of hypoxia-inducible factor-1α mRNA expression in mantis shrimp as a biomarker of environmental hypoxia exposure[J].Biology Letters,2012,8(2):278-281.

        [17]唐夏,黃國強(qiáng),李潔,等.低鹽度脅迫不同時(shí)間對(duì)褐牙鲆幼魚生長的影響[J].南方水產(chǎn)科學(xué),2012,8(3):10-16.

        [18]王瑞旋,王江勇,徐力文,等.軍曹魚養(yǎng)殖水體及其腸道弧菌的耐藥性研究[J].南方水產(chǎn),2007,3(5):1-6.

        [19]李庭古.鹽度對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2009,28(8):465-467.

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