李冬春，閆喜武，霍忠明，姚托，孫欣，張國范

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116023;2.中國海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島266003;3.中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生物技術(shù)研發(fā)中心，山東 青島266071)

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 隸屬于軟體動物門、雙殼綱、簾形目、簾蛤科、蛤仔屬，俗稱花蛤、沙蜆子等，是中國重要的灘涂養(yǎng)殖貝類。培育生長快、品質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良新品種，是蛤仔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的一條重要途徑。閆喜武等［1］研究表明，菲律賓蛤仔奶牛蛤品系具有生長快、抗逆性強(qiáng)和產(chǎn)量高的特點(diǎn)，且后代均為奶牛蛤。按殼色劃分，奶牛蛤品系在天然群體中占10%左右，是中國北方天然群體中產(chǎn)量最高的殼色品系。本研究中，以采用巢式設(shè)計(jì)建立的奶牛蛤全同胞家系作為基礎(chǔ)選擇群體，對其進(jìn)行了兩個(gè)世代的連續(xù)混合選擇。

選擇壓力是指選作育種對象的個(gè)體數(shù)占選擇前群體總個(gè)數(shù)的百分比，水產(chǎn)動物多數(shù)具有懷卵量大、繁殖力強(qiáng)的特性，這對于提高選擇壓力，淘汰更多個(gè)體是十分有利的［2］。蛤仔的繁殖力很強(qiáng)，一枚一齡蛤仔的一次產(chǎn)卵量為30 萬～40 萬粒［3］，這為提高蛤仔選育過程中的選擇壓力提供了前提條件。在現(xiàn)有關(guān)于貝類的選育研究中，對海灣扇貝［4］、菲律賓蛤仔［5-6］、雜色鮑［7］的選育均采用10%的選擇壓力，對華貴櫛孔扇貝［8］采用5%的選擇壓力。鑒于菲律賓蛤仔的高繁殖力，為了提高選育效率，本研究中采用1%的選擇壓力，對菲律賓蛤仔奶牛蛤品系進(jìn)行兩個(gè)世代連續(xù)混合選擇，計(jì)算并分析了選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力和遺傳獲得，以期評估該選擇方法的選育效果，為蛤仔新品種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2010年8月，從遼寧省大連市石河鎮(zhèn)海區(qū)采捕的野生菲律賓蛤仔中，挑選出貝殼完整、絞合力強(qiáng)的2 齡奶牛蛤約500 枚。奶牛蛤殼頂為白色或淺黃色，貝殼上有黑色、深墨綠色或深褐色不規(guī)則斑塊，外觀類似黑白花奶牛的毛色。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用巢式設(shè)計(jì)(♀∶♂=3∶1)，使用常見灘涂貝類的家系建立方法［9］，建立8 個(gè)父系半同胞家系和24 個(gè)全同胞家系。于2011年7月，將各家系子一代混合，得到蛤仔奶牛蛤品系的F1基礎(chǔ)選擇群體約5 萬枚。在此群體中隨機(jī)取500枚，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量殼長并記錄數(shù)據(jù)，繪制殼長頻率分布圖(圖1)。根據(jù)實(shí)際可操作性，在繪制頻率分布圖時(shí)，以0.5 mm 分組。用隨機(jī)抽取的這500 枚蛤仔作為對照組(CG1)。根據(jù)頻率分布圖，利用截頭法，以殼長最大的1%截點(diǎn)處殼長為標(biāo)準(zhǔn)(即頻率分布圖中最大的5 個(gè)個(gè)體所在組殼長)，在F1基礎(chǔ)群體中篩選出殼長大于或等于該截點(diǎn)處殼長的個(gè)體作為選擇組(SG1)(實(shí)際所選親本個(gè)數(shù)將在500 枚上下小幅度波動)。

圖1 蛤仔奶牛蛤品系F1 基礎(chǔ)群體殼長分布頻率圖及被選擇的親本(黑色部分)Fig.1 Shell length frequency profile of basic population and selected parents(black parts)in F1 generation in Manila clam strain with cow-like spots

將性腺發(fā)育成熟且處于臨產(chǎn)狀態(tài)的對照組和選擇組親貝移入室內(nèi)，陰干8 h 后，分別放入兩個(gè)盛有新鮮沙濾海水的60 L 白色聚乙烯塑料桶中，經(jīng)2 ～3 h，親貝開始產(chǎn)卵排精，以隨機(jī)交配的方式構(gòu)建子一代對照組CG1和選擇組SG1。親貝產(chǎn)卵1 ～2 h 后移出親貝，將桶中含受精卵的海水經(jīng)洗卵等操作后分至若干桶中進(jìn)行孵化，孵化密度為30 ～40 個(gè)/mL。經(jīng)24 h，受精卵全部發(fā)育為D 形幼蟲，再次分桶進(jìn)行幼蟲培育，幼蟲密度為4 ～5 個(gè)/mL。每2天調(diào)整各家系幼蟲密度，保持每個(gè)桶中幼蟲密度基本相同。根據(jù)幼蟲生長狀況，每天適量投餌2次，餌料為湛江等鞭金藻Isochrysiszhangjiangensis和小球藻Chlorella vulgaris(體積比為1∶1);每2天全量換水1次，為避免不同試驗(yàn)組個(gè)體混雜，每組換水的篩絹網(wǎng)單獨(dú)使用。幼蟲變態(tài)后，進(jìn)入稚貝培育期，此期適當(dāng)加大投餌量。試驗(yàn)期間，保證光照、水質(zhì)、溫度、充氣等各項(xiàng)條件和操作方法基本一致。待稚貝平均殼長大于500 μm 后，裝入60 目網(wǎng)袋中，移入室外土池吊養(yǎng)。根據(jù)稚貝生長情況，定期更換網(wǎng)袋和調(diào)整每個(gè)網(wǎng)袋中幼貝的密度，保證每個(gè)網(wǎng)袋幼貝密度基本一致。幼貝在大連市莊河海洋村育苗場溫室大棚內(nèi)的同一個(gè)水泥池中越冬，于2012年春天重新移入土池中吊養(yǎng)。

2012年6月底，以選擇組SG1的后代(即F2)約1.3 萬枚蛤仔作為子二代選擇群體，隨機(jī)抽取130 枚作為同一世代內(nèi)對照組(CG2)，同時(shí)從上一世代對照組CG1群體中隨機(jī)抽取130 枚作為世代間對照組(CC)。采取與上一個(gè)世代相同的方法，繪制殼長頻率分布圖(圖2)，在F2基礎(chǔ)群體中篩選出殼長大于或等于1%截點(diǎn)處殼長的個(gè)體130 枚作為選擇組(SG2)，用隨機(jī)交配方式構(gòu)建子三代的對照組CG2、CC和選擇組SG2。幼蟲的孵化、培育，以及稚貝和幼貝的養(yǎng)成方法均與上一世代相同。

殼長的測定:在幼蟲和室內(nèi)稚貝培育階段，對照組和選擇組均隨機(jī)挑選3 個(gè)桶，從每個(gè)桶中隨機(jī)取30 個(gè)個(gè)體，用目微尺(顯微鏡下)或數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量殼長;在幼貝室外土池培育階段，從每組隨機(jī)選取3 個(gè)網(wǎng)袋，從每個(gè)網(wǎng)袋中隨機(jī)取30 個(gè)個(gè)體，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量殼長。

1.2.2 選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力和遺傳獲得的計(jì)算選擇反應(yīng)是選擇前后群體平均值的改變，它是選擇親本的子代與選擇前整個(gè)親代平均表型值之差。對于貝類，由于養(yǎng)殖環(huán)境的年度差異，可造成選擇反應(yīng)較大的年度差異，因此，必須建立一個(gè)相當(dāng)于親代的對照組。選擇反應(yīng)(R)為選擇組與對照組的表型值之差，這個(gè)差值與對照組標(biāo)準(zhǔn)差的比值稱為標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)(RS)。通過標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)，可對不同年份、不同遺傳背景的選擇反應(yīng)進(jìn)行比較［10］。標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)(RS)的計(jì)算公式為

其中:OS和OC分別為選擇組和對照組子代的平均殼長;SC為對照組子代的標(biāo)準(zhǔn)差。

其中:i 為選擇強(qiáng)度，即標(biāo)準(zhǔn)化的選擇差，當(dāng)被選擇的基礎(chǔ)群體表型性狀服從正態(tài)分布時(shí)，在1%的選擇壓力下，i 值為2.6652;當(dāng)被選擇的基礎(chǔ)群體表型性狀不服從正態(tài)分布時(shí)，選擇強(qiáng)度i 的計(jì)算公式為

式中，PSG和PCG分別為選擇組和對照組親本的平均殼長，SP為對照組親本的標(biāo)準(zhǔn)差［11］。

遺傳獲得(GG)也稱遺傳進(jìn)展，是蛤仔群體經(jīng)人工選擇后，子代群體相對于親本群體表型平均值的百分增量，其計(jì)算公式為

總遺傳獲得(GGA)為連續(xù)選擇后產(chǎn)生的子代相對于第一代對照組的表型值平均值的百分增量，其計(jì)算公式為

其中:OCC為從第一代對照組后代中隨機(jī)挑選的與選擇組OS有相同親本數(shù)的對照組隨機(jī)交配所產(chǎn)生的后代。

圖2 蛤仔奶牛蛤品系F2 被選擇群體殼長分布頻率圖及被選擇的親本(黑色部分)Fig.2 Shell length frequency profile of basic population and selected parents(black parts)of F2 generation in Manila clam strain with cow-like spots

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的預(yù)處理和方差分析均采用SPSS 18.0 軟件的ANOVA和t 檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)世代蛤仔親本群體的性狀描述性統(tǒng)計(jì)、截點(diǎn)殼長和選擇強(qiáng)度

F1和F2兩個(gè)世代對照組CG、CC和選擇組SG的平均殼長，以及對照組CG 的變異系數(shù)、選擇截點(diǎn)處殼長和選擇強(qiáng)度如表1所示。F1世代的對照組CG1和F2世代的對照組CC 來自同一群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的兩個(gè)世代，在對殼長進(jìn)行選擇時(shí)均為11月齡，但兩者的殼長存在顯著性差異(P＜0.05)，說明環(huán)境因素對兩個(gè)世代的生長影響較大。由F2世代的對照組CG2和對照組CC 的平均殼長可以初步判定，對F1世代的混合選擇使群體殼長平均值提高了16.99%，選擇也使群體變異系數(shù)降低了35%。用SPSS 18.0 軟件對從兩個(gè)世代基礎(chǔ)群體中隨機(jī)抽取的500 個(gè)個(gè)體的殼長進(jìn)行K-S檢驗(yàn)，結(jié)果F1世代群體不服從正態(tài)分布，由式(3)求得選擇強(qiáng)度i 為4.5524;F2世代群體服從正態(tài)分布，查表得到選擇強(qiáng)度i 為2.6652。

2.2 兩個(gè)世代蛤仔在各生長階段的平均殼長

從表2可見:在F2世代中，除60日齡時(shí)選擇組SG1的平均殼長大于對照組CG1，但差異不顯著(P＞0.05)外，其他各生長階段，選擇組SG1的平均殼長均顯著大于對照組CG1(P＜0.05);在F3世代中，除30日齡與60日齡時(shí)選擇組SG2的平均殼長大于對照組CG2和CC，但差異不顯著(P ＞0.05)外，其他各生長階段，選擇組SG2的平均殼長均顯著大于對照組CG2和CC(P＜0.05)。由于生長環(huán)境的年固定效應(yīng)，在各個(gè)生長階段，F(xiàn)2世代的生長均優(yōu)于F3世代。

表1 兩個(gè)世代對照組和選擇組蛤仔親本群體的性狀描述性統(tǒng)計(jì)、截點(diǎn)殼長和選擇強(qiáng)度Tab.1 Descriptive statistics，cut-points of shell length and selection intensity of parents in the control and selected groups in the two generations

表2 兩個(gè)世代對照組和選擇組在各生長階段的平均殼長Tab.2 Average shell length at various growth periods in the control and selected groups in two generations μm

2.3 選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力和遺傳獲得

各生長階段蛤仔奶牛蛤品系殼長的選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力和遺傳獲得如表3所示。F2世代在各發(fā)育期的標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)(RS)依次為幼蟲期＞稚貝期＞幼貝期，F(xiàn)3世代在各發(fā)育期的標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)依次為幼蟲期＞幼貝期＞稚貝期;兩個(gè)世代標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)的峰值均出現(xiàn)在6日齡，F(xiàn)2世代標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)的總平均值(1.19)大于F3世代(0.90)。兩個(gè)世代在各發(fā)育期的現(xiàn)實(shí)遺傳力的變化趨勢與標(biāo)準(zhǔn)選擇反應(yīng)趨勢相同;F2世代的現(xiàn)實(shí)遺傳力為0.10 ～0.92，在幼蟲期、稚貝期和幼貝期的現(xiàn)實(shí)遺傳力平均值分別為0.43、0.16、0.14;F3世代的現(xiàn)實(shí)遺傳力為0.08 ～0.76，在幼蟲期、稚貝期和幼貝期的現(xiàn)實(shí)遺傳力平均值分別為0.41、0.26、0.28;兩個(gè)世代現(xiàn)實(shí)遺傳力的峰值均出現(xiàn)在6日齡;在幼蟲期，F(xiàn)2世代的現(xiàn)實(shí)遺傳力略大于F3世代，而稚貝期和幼貝期，F(xiàn)3世代的現(xiàn)實(shí)遺傳力均大于F2世代，F(xiàn)3世代現(xiàn)實(shí)遺傳力的總平均值(0.34)也大于F2世代(0.26)。兩個(gè)世代的遺傳獲得(GG)在幼蟲期均較小，F(xiàn)2和F3世代遺傳獲得的平均值分別為4.79%和5.60%;稚貝期F2世代遺傳獲得的平均值(17.81)大于F3世代(4.28)，而在幼貝期F2世代遺傳獲得的平均值(13.27)小于F3世代(16.30);F2世代遺傳獲得的總平均值(10.78%)大于F3世代(7.94%)。F3世代相對于F1世代，殼長在幼蟲期、稚貝期和幼貝期的總遺傳獲得(GGA)分別為10.73%、15.56%和29.34%，總 遺 傳 獲 得 平 均 值 為16.59%。

表3 兩個(gè)世代的選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力和遺傳獲得Tab.3 Response to selection，realized heritability and genetic gains in two generations

3 討論

對數(shù)量性狀進(jìn)行選育的本質(zhì)是通過人工選擇改變控制某性狀微效基因的基因頻率。在選育過程中，中選群體后代經(jīng)一代選擇，性狀未達(dá)到一致，就可通過連續(xù)多代混合選擇，使該性狀逐步穩(wěn)定。在本研究中，F(xiàn)1世代殼長的變異系數(shù)為21.40%，經(jīng)第一代選擇后，F(xiàn)2世代群體獲得了1.19 的總平均選擇反應(yīng)和10.78%的遺傳獲得，現(xiàn)實(shí)遺傳力為0.26。F2世代殼長的變異系數(shù)為13.91%，雖有一定程度的降低，但仍存在遺傳改良的空間，有必要進(jìn)行第二代混合選擇。經(jīng)第二代選擇后，F(xiàn)3的總平均選擇反應(yīng)為0.90，平均遺傳獲得為7.94%，總遺傳獲得為16.59%，現(xiàn)實(shí)遺傳力為0.34。由于條件的限制，對F3世代群體僅跟蹤測量到120日齡，若補(bǔ)齊270、330日齡殼長的測量結(jié)果，可能使F3世代的選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力、遺傳獲得和總遺傳獲得有一定范圍的波動。在對其他雙殼貝類的研究中，Newkirk等［12］對歐洲牡蠣Ostrea edulis的生長性狀進(jìn)行選擇，第一代的平均選擇反應(yīng)為23%;Nell等［13-14］對悉尼巖牡蠣Saccostrea commercialis 的體質(zhì)量進(jìn)行選擇，選擇一代的平均選擇反應(yīng)為4%，選擇兩代的平均選擇反應(yīng)為17.8%;Zheng等［4］對海灣扇貝Argopecten irradians 進(jìn)行連續(xù)混合選擇，選擇一代的平均選擇反應(yīng)和遺傳獲得分別為0.650和10.98%，選擇第二代的選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力、遺傳獲得和總遺傳獲得分別為0.612、0.349、10.63%和17.56%;張國范等［3］對菲律賓蛤仔3 個(gè)不同地理群體進(jìn)行兩代連續(xù)混合選擇，大連群體第一代選擇的平均選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力和遺傳獲得分別為0.690、0.393和11.80%，大連群體第二代選擇的平均選擇反應(yīng)、現(xiàn)實(shí)遺傳力、遺傳獲得和總遺傳獲得分別為0.628、0.358、10.58%和24.44%。本研究中的選擇反應(yīng)顯著高于張國范等［3］對蛤仔大連群體的研究結(jié)果，這是由于本研究中采用了較大的選擇壓力，選擇強(qiáng)度較大。兩代選擇的遺傳獲得和總遺傳獲得均低于其他研究結(jié)果，這是由于在親本遺傳效應(yīng)中，只有加性遺傳效應(yīng)能夠穩(wěn)定遺傳給后代，而選擇反應(yīng)是加性遺傳效應(yīng)和選擇壓力共同作用的結(jié)果［15］。本研究中的基礎(chǔ)群體遺傳力低于張國范等［3］報(bào)道的大連群體，這是造成遺傳獲得率低的重要原因。通過選擇可使水產(chǎn)動物每代獲得10% ～20%的遺傳進(jìn)展這一結(jié)論已被廣泛認(rèn)可［16］。本研究中，第二代的遺傳獲得雖低于10%，但相差不多，兩代得到總遺傳獲得為16.59%的結(jié)果仍是比較理想的。經(jīng)兩代連續(xù)選擇后，F(xiàn)3世代群體仍有0.34 的高現(xiàn)實(shí)遺傳力，說明牛奶蛤群體仍具有一定的改良潛力。

［1］閆喜武，孫欣，張躍環(huán)，等.菲律賓蛤仔奶牛蛤品系兩個(gè)世代的雜交與近交效應(yīng)［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011，35(5):682-691.

［2］范兆廷.水產(chǎn)動物育種學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

［3］張國范，閆喜武.蛤仔養(yǎng)殖學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2010.

［4］Zheng H P，Zhang G F，Liu X，et al.Sustained response to selection in an introduced population of the hermaphroditic bay scallop Argopecten irradians irradians Lamarck(1819)［J］.Aquaculture，2006，255:579-585.

［5］閆喜武，張躍環(huán)，霍忠明，等.不同地理群體菲律賓蛤仔的選擇反應(yīng)及現(xiàn)實(shí)遺傳力［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34(5):704-710.

［6］丁鑒鋒，楊霏，閆喜武，等.不同殼色菲律賓蛤仔免疫機(jī)能的比較研究［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(5):411-416.

［7］柯才煥，游偉偉.雜色鮑的遺傳育種研究進(jìn)展［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，50(2):425-430.

［8］Liu J Y，Liu Z G.Response to selection for shell length in the noble scallop，Chlamys nobilis(Reeve)［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11(36):8794-8799.

［9］閆喜武，張躍環(huán)，霍忠明，等.常見灘涂貝類的家系建立方法:中國，200810013220.2［P］.2008-09-12.

［10］張國范，鄭懷平.海灣扇貝養(yǎng)殖遺傳學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2009.

［11］翟虎渠，王建康.應(yīng)用數(shù)量遺傳［M］.2 版.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007.

［12］Newkirk G F，Haley L E.Progress in selection for growth rate in the European oyster Ostrea edulis［J］.Mar Ecol Prog Ser，1982，10:77-79.

［13］Nell J A，Sheridan A K，Smith I R.Progress in a Sydney rock oyster Saccostrea commercialis(Iredale and Roughley)breeding program［J］.Aquaculture，1996，144:295-302.

［14］Nell J A，Smith I R，Sheridan A K.Third generation evaluation of Sydney rock oyster Saccostrea commercialis(Iredale and Roughley)breeding lines［J］.Aquaculture，1999，170:195-203.

［15］Falconer D S，Mackay T F C.Introduction to Quantitative Genetics［M］.Essex:Longman Group，1996.

［16］Gjedrem T.Genetic improvement of cold-water species［J］.Aquaculture Research，2000，31:25-33.