李莉萍，王瑞，黃婷，梁萬文，雷愛瑩，李健，黃維義，唐佳有，施金谷，甘西，陳明、

(1.廣西水產(chǎn)科學研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧530021;2.廣西大學 動物科學技術學院，廣西南寧530005)

2009—2012年中國養(yǎng)殖羅非魚Oreochromis niloticus 大面積暴發(fā)流行鏈球菌病，累計死亡率為30% ～90%，每年給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟損失10 ～15億元，嚴重影響了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。該病發(fā)病區(qū)域逐年擴大，發(fā)病率和死亡率逐年遞增，染病羅非魚的規(guī)格逐年增大，以前不易感染鏈球菌的魚苗也出現(xiàn)大批死亡［1-5］。每年都有新的流行病狀出現(xiàn)，從之前感染鏈球菌的羅非魚出現(xiàn)突眼、游姿異常等癥狀到出現(xiàn)無任何明顯癥狀即發(fā)生死亡，不同區(qū)域的菌株致病力、藥物敏感性和耐藥性均存在差異［6］。2009年前部分養(yǎng)殖區(qū)域還可以用抗生素控制部分病情，但2010年之后抗生素幾乎不產(chǎn)生實際效果，多數(shù)養(yǎng)殖戶只能選擇停料處理。疫苗是防治該病的有效途徑，但據(jù)報道疫苗在不同養(yǎng)殖場使用時，其免疫保護率差異較大，有些養(yǎng)殖場的疫苗保護率僅達到50%，還有些養(yǎng)殖場完全無法顯示免疫保護作用［7-10］。

對羅非魚鏈球菌病流行菌株進行血清型鑒定有助于掌握病原的起源、分布和傳播等流行病學信息，科學地選擇有效的疫苗和防治措施。目前，國內(nèi)關于羅非魚鏈球菌病流行菌株血清型分析的研究較少，郭玉娟等［4］對2007年、2008年分別從福建省和海南省分離獲得的各2 株無乳鏈球菌和2009—2010年從廣東省肇慶市8 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離獲得的21 株無乳鏈球菌進行分子血清型鑒定，結(jié)果全部鑒定為Ⅰa 型;Ye等［11］2009—2010年對從廣東省5 個地區(qū)的10 個養(yǎng)殖場和海南省3 個地區(qū)的6 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離獲得的14 株無乳鏈球菌進行分子血清型鑒定，結(jié)果同樣全部是Ⅰa 型。上述兩項研究的流行菌株主要集中于部分省市的部分區(qū)域，而羅非魚鏈球菌病流行情況近些年發(fā)生的巨大變化和區(qū)域差異，提示流行菌株可能存在差異性和多樣性。因此，有必要對中國羅非魚鏈球菌病進行更全面的流行菌株分離鑒定及血清型分析。本研究中，采用PCR 方法對廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室2007—2012年從廣西、廣東、海南、福建和云南5 省羅非魚主養(yǎng)區(qū)145 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離到的168 株無乳鏈球菌進行血清型分析，旨在掌握羅非魚無乳鏈球菌流行菌株血清型及流行病學情況，為該病的防治及疫苗研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

血平板購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司;TSB 培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司;細菌DNA 抽提試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品;引物由寶生物工程(大連)有限公司合成;Taq DNA 聚合酶、10 ×buffers、dNTPs、DL2000 Maker均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;Gel -red核酸染料購自Biotium 公司。

羅非魚鏈球菌病流行菌株為廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室于2007—2012年從廣西、廣東、海南、福建和云南羅非魚養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的鏈球菌病流行菌株，經(jīng)生化鑒定及特異性PCR 驗證，其中168 株為無乳鏈球菌，詳細記錄菌株相關信息后，于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

細菌DNA 的抽提:從冰箱中取出無乳鏈球菌，環(huán)劃線接種于血平板上。待平板上長出單個菌落時，染色鏡檢，確認無污染之后，挑取單個菌落置于TSB 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下培養(yǎng)24 h，取1.5 mL 菌液，以9000 r/min 離心10 min，棄上清，按細菌DNA 抽提試劑盒說明書提取菌體DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴增:按文獻［12］中報道的10種血清型特異性引物序列合成引物(表1)。

表1 無乳鏈球菌血清型特異性引物序列和PCR 擴增產(chǎn)物片段Tab.1 Sequence of serotype-specific primers and PCR products of amplification in Streptococcus agalactiae

目前報道的羅非魚無乳鏈球菌大部分為Ⅰa型，因此，本試驗中將所有菌株DNA 先用Ⅰa 血清型引物進行擴增，Ⅰa 血清型引物擴增不出的菌株再用Ⅰb 血清型引物進行擴增，Ⅰb 血清型引物還未擴增出的菌株再用Ⅲ血清型引物進行擴增，另外再用其余7種血清型引物分別對所有代表菌株DNA 混合物進行擴增輔助驗證。通過對PCR 擴增的退火溫度、引物濃度、dNTP 濃度和Taq DNA 聚合酶濃度進行優(yōu)化，最終確定PCR 反應體系為50 μL，包括:10 × Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，引物各2.0 μL，DNA 模板2.0 μL(約50 ng)，5 U/μL Ex Taq(TaKa-Ra 公司)1.0 μL，ddH2O 36.0 μL。PCR 反應條件:94 ℃下預變性5 min;94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火1 min，72 ℃下延伸60 s，共進行35 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR 陽性擴增產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 血清型分析

8 株Ⅰa 血清型代表菌株、6 株Ⅰb 血清型菌株和3 株Ⅲ血清型菌株的特異PCR 擴增結(jié)果見圖1。8 株Ⅰa 血清型代表菌株擴增出521 bp 的特異性片段(孔1 ～8)，6 株Ⅰb 血清型菌株擴增出770 bp特異性片段(孔9 ～14)，3 株Ⅲ血清型菌株擴增出1826 bp 特異性片段(孔15 ～17)，空白對照未擴增出條帶(孔18 ～20)，其余7種血清型引物對所有代表菌株DNA 混合物未擴增出條帶(孔21 ～27)。擴增目的片段測序結(jié)果在GenBank 中進行Blast 比對，結(jié)果顯示，測序結(jié)果與GenBank 中無乳鏈球菌相應基因序列的同源性為99% ～100%。

2.2 各省區(qū)羅非魚鏈球菌病流行菌株血清型鑒定

經(jīng)過血清型特異性PCR 分析，168 株羅非魚鏈球菌病流行菌株中，有159 株為Ⅰa 型，6 株為Ⅰb型，3 株為Ⅲ型。其中2007—2012年從廣西南寧、北海、玉林、柳州、百色、欽州和崇左7 個地區(qū)50 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的61 株無乳鏈球菌中，有54 株為Ⅰa 型，4 株為Ⅰb 型，3 株為Ⅲ型(表2);2010—2012年從廣東省茂名、湛江、珠海、陽江、惠州、汕頭、揭陽、高州、化州和肇慶10 個地區(qū)59 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的64 株無乳鏈球菌中，有63 株為Ⅰa 型，1 株為Ⅰb 型(表3);2009—2012年從海南省臨高、?？?、文昌、澄邁和瓊海5 個地區(qū)26 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的33 株無乳鏈球菌中，有32 株為Ⅰa 型，1 株為Ⅰb 型(表4);2010年從福建省漳州6 個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的6 株和2012年從云南省文山4個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的4 株無乳鏈球菌，均為Ⅰa 型(表5和表6)。

圖1 羅非魚無乳鏈球菌特異性PCR 血清型分析Fig.1 Specific PCR serotype assays of Streptococcus agalactiae isolated from Nile tilapia

3 討論

根據(jù)無乳鏈球菌莢膜多糖的不同，可以將無乳鏈球菌分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅷ、dltS 共10種血清型［12］。無乳鏈球菌傳統(tǒng)血清型鑒定常用蘭氏分類法，根據(jù)抗原與已知血清型抗體反應結(jié)果進行鑒定，如免疫沉淀、酶免疫測定、協(xié)同凝集試驗、對流免疫電泳、毛細管沉淀試驗等，這些方法必須有特異性血清抗體且工作量較大［13］。另外，由于莢膜多糖某些基因在不同情況下可能不表達或表達量較低，達不到與抗血清反應要求，利用傳統(tǒng)方法鑒定可造成部分無乳鏈球菌菌株血清型無法分型;同時由于缺少魚類特異性血清而使用人源標準抗血清，并且市場上也僅有6種人用血清型鑒定試劑盒，導致部分魚源菌株不能與其反應，無法分型［14-15］。隨著分子生物學的發(fā)展和無乳鏈球菌全基因組測序的完成，建立了多種莢膜區(qū)域血清型特異基因的檢測方法并得到完善和發(fā)展，如PCR［16］、PFGE［17］、mPCR/RLB［18］方法。該類方法可在普通分子實驗室條件下完成，具有分辨率高、特異性強、操作簡單快速、重復性好等特點，分型結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)果相符，并且還能鑒定出傳統(tǒng)方法鑒定不出的血清型。其中，PCR 分型方法具有高敏感性，可檢測出微量的DNA，并且對DNA 的純度要求沒有像酶切分析、雜交分析等那樣高，可以直接對臨床樣品進行檢驗;同時PCR 引物是化學合成的，具有穩(wěn)定、可預測的特點，易于標準化［19］。Kong等［20］對206 株無乳鏈球菌臨床菌株進行傳統(tǒng)方法鑒定和PCR 分型比較，傳統(tǒng)方法能夠鑒定出188 株(91.3%)，而PCR 分型可以鑒定出所有菌株，同時用PCR 分型與傳統(tǒng)方法鑒定的188株菌株血清型完全一致。采用PCR 方法對羅非魚無乳鏈球菌進行血清型分析，不但操作簡單快速，而且分析結(jié)果準確可靠。目前PCR 分型方法主要包含3種技術，如PCR 加雜交、PCR 加酶切、PCR 加序列分析。本研究中，主要參考Poyart等［12］無乳鏈球菌血清型多重PCR 分型方法，該方法可檢測出10種已知血清型。但該文獻并未報道此多重PCR 的反應體系和反應條件，向該文作者咨詢也未予回復。為保證試驗結(jié)果的準確可靠，根據(jù)目前報道的羅非魚無乳鏈球菌分為3 個血清型(Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ)［21-22］，本試驗中對PCR 反應進行了合理設計和優(yōu)化。所有菌株的DNA 先用Ⅰa型引物擴增，Ⅰa 型引物擴增不出的菌株再用Ⅰb型引物擴增，Ⅰb 型引物還未擴增出的菌株再用Ⅲ型引物擴增，最后用其余7種血清型引物分別對所有代表菌株的DNA 混合物擴增輔助驗證。通過研究發(fā)現(xiàn)，退火溫度為58 ℃，退火時間為1 min 時，3 個血清型均能擴增出特異目的片段，PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果證明，擴增條帶為目的序列，證明建立的方法準確可靠。

表2 2007—2012年從廣西自治區(qū)分離獲得的羅非魚無乳鏈球菌流行菌株信息表Tab.2 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Guangxi during 2007—2012

表3 2010—2012年從廣東省分離獲得的羅非魚無乳鏈球菌流行菌株信息表Tab.3 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Guangdong Province during 2010—2012

表4 2009—2012年從海南省分離獲得的羅非魚無乳鏈球菌流行菌株信息表Tab.4 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Hainan Province during 2009—2012

表5 2010年從福建省分離獲得的羅非魚無乳鏈球菌流行菌株信息表Tab.5 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Fujian Province in 2010

表6 2012年從云南省分離獲得的羅非魚無乳鏈球菌流行菌株信息表Tab.6 Information on epidemic strains of S.agalactiae isolated from Nile tilapia in Yunnan Province in 2012

目前國外報道，羅非魚無乳鏈球菌血清型包括Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ共3種血清型且以Ⅰa 型為主，而國內(nèi)僅報道1種血清型(Ⅰa)，推測可能是由于菌株來源區(qū)域范圍小，菌株分離時間跨度較窄所致。本試驗中收集了從中國主要羅非魚養(yǎng)殖區(qū)廣東省10 個地區(qū)的59 個養(yǎng)殖場，廣西自治區(qū)7 個地區(qū)的50 個養(yǎng)殖場，海南省5 個地區(qū)的26 個養(yǎng)殖場，福建省1 個地區(qū)的6 個養(yǎng)殖場，云南省1 個地區(qū)的4個養(yǎng)殖場的羅非魚中分離的共168 株羅非魚無乳鏈球菌進行血清型分析，在時間和地域上均有很好的代表性。鑒定結(jié)果顯示，168 株羅非魚無乳鏈球菌中，Ⅰa 血清型159 株(占94.64%)，Ⅰb 血清型6 株(占3.57%)，Ⅲ血清型3 株(占1.79%)，與國外報道的羅非魚有Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3種血清型一致。研究結(jié)果表明，中國羅非魚無乳鏈球菌主要以Ⅰa 血清型為主。廣東、海南省有Ⅰa、Ⅰb 兩種血清型，廣西自治區(qū)有Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ3種血清型，其他省份是否也存在多種血清型還需進一步研究。廣東、海南省流行菌株比較穩(wěn)定，除了2010年發(fā)現(xiàn)2 株Ⅰb 型菌株，再沒有其他新血清型出現(xiàn)。血清型分析主要是針對細菌表面某個成分進行的，可以總體了解當?shù)亓餍芯晏攸c及發(fā)生變異的速度和頻率，但是中國羅非魚鏈球菌病流行情況復雜，新病情不斷出現(xiàn)，相同血清型菌株的抗原性及耐藥性可能存在較大差異。因此，在對菌株進行血清型鑒定之后，還可利用分辨率更高的分型技術，如PFGE 技術，對這些流行菌株進行分型，獲得菌株之間更細微的差異信息，同時與血清型分型結(jié)果進行比較分析，進一步明確感染來源和暴發(fā)因素，分析流行規(guī)律和特點，為預防控制該病及篩選疫苗候選菌株提供參考［23-27］。

廣西自治區(qū)的中國羅非魚產(chǎn)量位居全國第三，近年來也一直深受鏈球菌危害。從2007—2009年，廣西只有Ⅰb 血清型，2010年出現(xiàn)Ⅰa 血清型，2011年出現(xiàn)Ⅲ血清型，新血清型出現(xiàn)間隔時間較短。廣西北海市從2007—2012年短短6年時間，出現(xiàn)3種血清型。特別值得注意是，在同一個養(yǎng)殖場、同樣的時間內(nèi)，可分離到2種不同血清型菌株(GX033和GX034)。北海市作為廣西自治區(qū)羅非魚養(yǎng)殖的主要地區(qū)，與廣東、海南兩省相鄰，養(yǎng)殖苗種多從這兩省購進，同時又自繁部分苗種，伴隨養(yǎng)殖環(huán)境惡化、養(yǎng)殖密度增加、抗生素濫用，大大增加了流行菌株發(fā)生變異的可能性，導致血清型呈現(xiàn)多樣性。研究證實，無乳鏈球菌可在人、奶牛、小鼠、蜥蜴和羅非魚間進行交叉感染，人和奶牛的無乳鏈球菌都可以感染魚［28-30］。羅非魚鏈球菌也嚴重威脅到人類健康與安全。截至目前，在北美和亞洲已有9 例羅非魚海豚鏈菌感染人的病例報道，感染途徑均是患者直接接觸發(fā)病羅非魚引起［31］。從2012年廣西柳州市，分離到一株Ⅲ型菌株，與北海市不同，柳州市苗種引進比較單一，離其他羅非魚主養(yǎng)區(qū)較遠，理論上其血清型應該比較單一，但實際上并非如此。據(jù)調(diào)查，距離該菌株來源的羅非魚養(yǎng)殖場100 米處有一個奶牛場，而牛無乳鏈球菌主要血清型正是Ⅲ型［18］，因此，可能是通過人員流動或水流把人、牛源的Ⅲ型無乳鏈球菌傳染給了羅非魚。究竟是無乳鏈球菌在魚體內(nèi)進行重組產(chǎn)生變異還是來源于人、牛源無乳鏈球菌，還需要進一步試驗驗證。但由此可能引發(fā)的公共衛(wèi)生事件，卻值得我們提高警惕，如國內(nèi)暴發(fā)的禽流感［32-34］、豬鏈球菌感染人［35-37］事例，都是菌株在長期進化過程中適應環(huán)境發(fā)生變異進而引發(fā)人畜共患。因此，對羅非魚鏈球菌病流行病學進行深入研究，密切注意鏈球菌流行菌株的變化情況，及時掌握菌株來源和傳播途徑，不但對羅非魚鏈球菌病防治具有重要意義，也為公共衛(wèi)生建設和未來應對可能由鏈球菌引起的突發(fā)事件提供參考依據(jù)。

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