姚學(xué)良，徐曉麗，李賀密，包海巖，任涵瑋，鄭艷坤

(天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津300221)

紅尾皇冠魚Aequidens rivulatus 又名綠面皇冠，隸屬于慈鯛科，原產(chǎn)于南美洲，為當(dāng)?shù)氐氖秤敏~。1999年作為觀賞魚被引入中國香港，2000年在中國大陸繁殖成功。紅尾皇冠魚飼養(yǎng)要求不高，深受廣大觀賞魚愛好者的喜愛，但隨著其養(yǎng)殖的規(guī)?；?、集約化發(fā)展，紅尾皇冠魚病害問題凸顯。中國學(xué)者一直致力于食用魚的病害診斷與防治，對觀賞魚病害的診斷和防治基本沿用食用魚的方法，有關(guān)觀賞魚疾病診斷與防治的研究目前鮮有報道。

無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae是在慈鯛科觀賞魚中流行的一種細(xì)菌病，目前該菌的診斷主要通過對病原菌的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法檢測［1］，該方法費時且缺乏準(zhǔn)確性。PCR和Real time PCR的應(yīng)用提高了微生物檢測的準(zhǔn)確性［2-3］，但復(fù)雜的操作技術(shù)使其在生產(chǎn)實踐中一直未得到廣泛應(yīng)用。因此，操作簡單、快速的野外現(xiàn)場檢測方法亟待研發(fā)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop -mediated isothermal mplification，LAMP)是由Notomi等［4］于2000年首次建立的體外鏈置換核酸擴增方法，近年來被廣泛研究與應(yīng)用。它利用靶序列上6 個關(guān)聯(lián)區(qū)域設(shè)計的4 條特異引物和1種高活性鏈置換DNA 聚合酶(BstDNA polymerase)，在恒溫下對目的片段的擴增效率可達109～1010個數(shù)量級，基于該原理的LAMP 技術(shù)已在水產(chǎn)動物細(xì)菌、病毒、寄生蟲病原的快速檢測中被廣泛研究與應(yīng)用［5-8］。與常規(guī)的基因診斷技術(shù)相比，該技術(shù)因其檢測時間短、對設(shè)備的要求低、結(jié)果判斷簡便等，在現(xiàn)場操作方面具有更大的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;無乳鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌Photobacterium damselae、柱狀黃桿菌Flavobacterium cloumnare、哈維氏弧菌Vibrio harveyi、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、諾卡氏菌Nocardia asteroides、愛德華氏菌Edwardsiella tarda、維氏氣單胞菌Aeromonas veronii、鰻利斯頓氏菌Listonella anguillarum、創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus 參考株為天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站保藏。

1.1.2 主要試劑 BstDNA ploymerase 購自New England Biolab 公司，DL2000 DNA Marker 購自大連寶生物工程有限公司，鈣黃綠素購自Sigma公司，F(xiàn)TA 卡購自GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP 引物設(shè)計 依據(jù)GenBank 報道的無乳鏈球菌的 cfb 基因保守序列(登錄號:X72754.1)，設(shè)計兩對LAMP 引物，包括兩條外引物(F3、B3)和兩條內(nèi)引物(FIP、BIP)，引物序列見表1。

表1 無乳鏈球菌cfb 基因LAMP 檢測的引物序列Tab.1 Details of LAMP primers designed for detection of cfb gene of Streptococcus agalactiae

1.2.2 LAMP 反應(yīng)及條件優(yōu)化

(1)LAMP 擴增。LAMP 反應(yīng)體系(共25 μL):10 × Thermo Polbuffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 1.5 μL，5 μmol/L 內(nèi) 引 物 各1 μL，40 μmol/L外引物各1 μL，模板1 μL，BstDNA polymerase(8 U)1 μL，鈣黃綠素1 μL，ddH2O 14 μL。于65 ℃下孵育40 min，85 ℃下終止反應(yīng)10 min。肉眼觀察產(chǎn)物的反應(yīng)情況，并用10 g/L 瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

(2)條件優(yōu)化試驗。分別改變LAMP 擴增條件:反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、內(nèi)外引物濃度，用電泳觀察擴增結(jié)果。

(3)特異性試驗。用上述建立的LAMP 方法分別對無乳鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌和創(chuàng)傷弧菌10 個菌株進行擴增，驗證方法的特異性。

(4)靈敏度驗證試驗。將濃度為3 ×108cfu/mL的原始菌液進行10 倍梯度稀釋，分別作為模板，進行LAMP 靈敏度檢測。另取1.0 mL 濃度為3 ×108cfu/mL的無乳鏈球菌培養(yǎng)液，按文獻［9］中的方法進行稀釋、傾注培養(yǎng)和細(xì)菌計數(shù)。

(5)LAMP 產(chǎn)物的酶切鑒定。利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ對LAMP 擴增產(chǎn)物進行酶切鑒定。反應(yīng)體系(共20 μL):10 ×K Buffer 2 μL，100 ×BSA 0.2 μL，BamHⅠ內(nèi)切酶0.5 μL，LAMP 擴增產(chǎn)物2 μL，ddH2O 15.3 μL。于37 ℃條件下作用16 h，電泳觀察酶切結(jié)果。

(6)LAMP在無乳鏈球菌病檢測中的應(yīng)用。為評價無乳鏈球菌LAMP 檢測方法的有效性，分別對攻毒紅尾皇冠魚、健康無病的紅尾皇冠魚進行LAMP 檢測。取紅尾皇冠魚的肝臟約0.1 g，置于采樣管中，用研磨棒快速將樣品研磨至漿狀;用吸管吸取漿狀的樣品使FTA 膜片充分潤濕，再吸取快速干燥液滴于FTA 膜片上，將FTA 膜片在室溫下靜置5 min，然后轉(zhuǎn)移到漂洗管內(nèi)，將漂洗管劇烈震蕩3 min，再將漂洗管內(nèi)的FTA 膜片轉(zhuǎn)移到擴增檢測管內(nèi)，于65 ℃下保溫40 min。同時取無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株和雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照。同步取樣品魚組織進行細(xì)菌分離、培養(yǎng)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 檢測方法的建立

本研究中建立了無乳鏈球菌肉眼可判讀的LAMP 檢測技術(shù)(圖1)，并對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和內(nèi)外引物濃度等條件進行優(yōu)化。試驗結(jié)果表明:就本研究中擬定的反應(yīng)體系而言，65 ℃時效果最佳(圖2);體系在30 min 時即有擴增反應(yīng)，60 min 時效果最佳(圖3);內(nèi)外引物濃度除(0.4，0.05)μmol/L 組條帶較弱外，其余3 組均無明顯差異(圖4)。

圖1 無乳鏈球菌的LAMP 檢測結(jié)果Fig.1 Detected result of Streptococcus agalactiae LAMP

2.2 特異性試驗

本研究中建立的擴增方法，對無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和無乳鏈球菌參考株呈陽性反應(yīng);對美人魚發(fā)光桿菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌、創(chuàng)傷弧菌9 株病原菌均呈陰性反應(yīng)(圖5)。

圖2 反應(yīng)溫度對LAMP 擴增的影響Fig.2 Effect of temperatures on LAMP amplification

圖3 反應(yīng)時間對LAMP 擴增的影響Fig.3 Effect of time on LAMP amplification

圖4 內(nèi)外引物濃度對LAMP 擴增的影響Fig.4 Effect of primer concentration on LAMP amplification

2.3 靈敏度試驗

當(dāng)菌液稀釋1 ×107倍及以上時擴增無產(chǎn)物。計數(shù)結(jié)果表明:1 ×106倍稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)液的菌濃度為3.7 ×102cfu/mL，即LAMP 檢測的靈敏度為3.7 ×101～3.7 ×102cfu/mL(圖6)。

圖5 LAMP 特異性試驗結(jié)果Fig.5 Results of specificity test on LAMP

圖6 無乳鏈球菌LAMP 檢測的靈敏度Fig.6 Sensitivity of LAMP in the detection of Streptococcus agalactiae

2.4 酶切試驗

采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ進行酶切，以確定所得產(chǎn)物為cfb 基因的擴增產(chǎn)物。BamHⅠ內(nèi)切酶位于內(nèi)引物B1c 上，根據(jù)Notomi等［4］已報道的計算方法，計算出經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的片段分別為198、246、327 bp。酶切產(chǎn)物電泳后得到與預(yù)期相同的片段(圖7)，說明建立的LAMP 擴增產(chǎn)物為無乳鏈球菌cfb 基因的目的片段。

圖7 LAMP 產(chǎn)物的BamHⅠ酶切分析Fig.7 Analysis of LAMP products digested with BamHⅠ

2.5 LAMP 技術(shù)在無乳鏈球菌檢測中的應(yīng)用

對取自健康紅尾皇冠魚的肝臟組織進行LAMP檢測，結(jié)果呈陰性。而對取自攻毒紅尾皇冠魚的肝臟組織進行LAMP 檢測，結(jié)果呈陽性(圖8)，且用該技術(shù)檢測的結(jié)果與同步對所取魚組織樣品進行的常規(guī)生化鑒定和16S rRNA 細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果一致。此結(jié)果驗證了LAMP 技術(shù)的準(zhǔn)確性和靈敏度均較高，可以在病害流行之前發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚類攜帶病原菌的情況，有利于及時采取有效防控措施。

圖8 患病紅尾皇冠魚肝臟組織中無乳鏈球菌的LAMP檢測結(jié)果Fig.8 Result of LAMP in the detection of S.agalactiae in liver of green terror A.rivulatus

3 討論

鏈球菌病是一種廣泛危害水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的致死性細(xì)菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。無乳鏈球菌屬人、畜、魚共患病原菌，是女性生殖道、新生兒感染和奶牛乳腺炎的重要病原菌［10-11］。近年來，國內(nèi)魚源無乳鏈球菌對水產(chǎn)行業(yè)威脅多集中在羅非魚產(chǎn)業(yè)［12-14］，已引起有關(guān)部門的重視，而由其引起的觀賞魚疾病鮮有報道。觀賞魚病害防治與食用魚大體相同，但因其觀賞性，在防治上要求更高的技術(shù)支持，如突眼、豎鱗等疾病，即使治愈，也會嚴(yán)重影響其商業(yè)價值。而名貴觀賞魚因其價格昂貴，對傳統(tǒng)的疾病檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。因此，能夠在觀賞魚養(yǎng)殖生產(chǎn)現(xiàn)場，快速、準(zhǔn)確地檢測早期病原的方法亟待研發(fā)。

cfb 基因為B 群鏈球菌特有基因(GBS - specificgene cfb，CAMP factor - specificgene)，編 碼CAMP 因子或溶血促進因子(cohemolysin)的膜外蛋白，它能與金黃色葡萄球菌分泌的B 溶血毒素神經(jīng)磷脂酶(sphingomyelinase)作用呈CAMP 反應(yīng)［15-16］，即促進綿羊紅細(xì)胞的溶血及胞膜成分的溶解。CAMP 因子是一種強毒力因子，在抗吞噬作用與細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞等方面起著重要作用。其類似因子在A、C和G 群鏈球菌中也存在，但它們編碼的基因間同源性較低。因此，CAMP 因子編碼基因cfb 已成為鑒定無乳鏈球菌的重要指標(biāo)之一。

本研究中，利用cfb 基因保守序列設(shè)計兩對LAMP 特異引物對無乳鏈球菌進行擴增。結(jié)果顯示:僅無乳鏈球菌擴增出特異性片段，而其他9 株致病菌株均未擴增出該片段，這證明cfb 基因作為鏈球菌種間鑒定依據(jù)的可行性。為了確定最佳檢測條件，本研究中，針對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和內(nèi)外引物濃度等條件進行優(yōu)化，初步建立了較穩(wěn)定、特異的無乳鏈球菌LAMP 檢測體系。溫度優(yōu)化試驗顯示，60、63、65 ℃下反應(yīng)效率差異不大，為綜合考慮酶的催化效率、反應(yīng)的穩(wěn)定性和特異性，將最終的反應(yīng)溫度確定為65 ℃。為提高反應(yīng)特異性，檢測時間確定為40 min。內(nèi)外引物濃度參照Notomi等［4］的方法，內(nèi)引物(1.6 μmol/L)與外引物(0.20 μmol/L)的比例為8∶ 1，為了提高反應(yīng)的特異性對該引物濃度做了稀釋，但內(nèi)外引物濃度比例不變，內(nèi)外引物濃度分別為(0.4，0.05)、(0.8，0.10)、(1.2，0.15)、(1.6，0.20)μmol/L。結(jié)果表明，(0.8，0.10)μmol/L 內(nèi) 外 引 物 濃 度 組 與(1.6，0.20)μmol/L 內(nèi)外引物濃度組無明顯差異，最后將反應(yīng)的內(nèi)外引物濃度確定為(0.8，0.10)μmol/L。此外，反應(yīng)顯色劑采用鈣黃綠素，濃度參照張琳等［17］的方法，采用0.05 mmol/L 鈣黃綠素和0.6 mmol/L MnCl2的混合物。鈣黃綠素直接加入反應(yīng)體系，從反應(yīng)開始至結(jié)果判讀無需再打開反應(yīng)管，可以有效地避免因形成氣溶膠而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。此外，試驗直接以菌體作為檢測模板，無需煮沸或提取DNA，制備LAMP 模板。現(xiàn)場應(yīng)用結(jié)合FTA 卡快速提取核酸，排除了病魚組織對試驗的影響。兩種制備模板的方法均具有簡便、快速的特點。該方法從樣本處理到結(jié)果判讀僅需1 h。

綜上所述，本研究中建立了操作簡便、靈敏度高、判讀簡單的檢測方法，在紅尾皇冠魚無乳鏈球菌病的野外快速檢測方面具有極大的實用性。

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