夏潤(rùn)林，潘厚軍，趙飛，方翔，石存斌，李華，吳淑勤

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510380)

多子小瓜蟲(chóng)Ichthyophthirius multifiliis是一種能感染淡水魚(yú)類(lèi)的重要纖毛蟲(chóng)，主要寄生于魚(yú)的體表和鰓，引起“白點(diǎn)病”，對(duì)魚(yú)的種類(lèi)及年齡均無(wú)嚴(yán)格選擇性，分布很廣，在世界范圍內(nèi)能引起養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)大量死亡，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和觀賞魚(yú)貿(mào)易中可造成重大經(jīng)濟(jì)損失［1-3］。多子小瓜蟲(chóng)的生活史分成感染性幼蟲(chóng)、寄生的滋養(yǎng)體和繁殖的包囊三個(gè)階段［4］，其幼蟲(chóng)階段和包囊階段都是在水體中完成，因此，水溫是其生存和繁衍后代最重要的因素之一。水溫的變化對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的包囊孵化［5］、幼蟲(chóng)活力［5］、感染率［6］和繁殖率［7］都有一定的影響。多數(shù)研究者［8-11］認(rèn)為，小瓜蟲(chóng)病適宜發(fā)生的水溫為15 ～25℃，當(dāng)水溫在30 ℃左右時(shí)，多子小瓜蟲(chóng)包囊的存活率僅約10%，而且包囊都不能孵化［5］，因而在多子小瓜蟲(chóng)的防控實(shí)踐中，有將水溫調(diào)高到28 ℃以上防治小瓜蟲(chóng)的報(bào)道［12-14］。也有研究者發(fā)現(xiàn)，水溫在26 ～29 ℃時(shí)，小瓜蟲(chóng)病依然發(fā)生，并能感染淡水魚(yú)［15］。筆者最近在養(yǎng)殖的過(guò)程中亦發(fā)現(xiàn)，在30 ℃左右水溫時(shí)多子小瓜蟲(chóng)仍能大量感染草魚(yú)。因此，揭示在高溫環(huán)境中多子小瓜蟲(chóng)感染和存活的生理機(jī)制成為寄生蟲(chóng)防治中迫切需要解決的問(wèn)題。張其中等［5］研究表明，水溫在4 ℃左右或28 ～32℃時(shí)，多子小瓜蟲(chóng)都不能孵化，但有少部分蟲(chóng)體以包囊形式存活下來(lái)，推測(cè)當(dāng)溫度降到適宜時(shí)，包囊能孵化為幼蟲(chóng)，成為再次暴發(fā)小瓜蟲(chóng)病的根源。但多子小瓜蟲(chóng)高溫應(yīng)激的分子機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

熱激蛋白(Heat-shock proteins，HSPs)是生物適應(yīng)環(huán)境溫度變化的重要媒介分子，過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞或機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，迅速合成HSP，并作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解等過(guò)程，以維持細(xì)胞蛋白自穩(wěn)，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的耐受性，增強(qiáng)抗氧化作用，使細(xì)胞維持正常的生理功能［16-17］。HSP70 為HSPs 中最保守、最重要的一簇，其在大多數(shù)生物中含量較多，在應(yīng)激反應(yīng)中最敏感［18］，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［19-20］、細(xì)胞衰老［21-22］和生育［23］過(guò)程中均起著重要的作用。研究表明，環(huán)境溫度升高時(shí)，可以增強(qiáng)HSP70 基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的存活，抑制細(xì)胞凋亡［24］。當(dāng)溫度升高時(shí)，嗜熱四膜蟲(chóng)Tetrahymena thermophila在生長(zhǎng)、饑餓和接合生殖等生理或發(fā)育狀態(tài)下，HSP70 基因的表達(dá)水平隨溫度的升高而增加［17］。同樣，可用HSP70 檢測(cè)不同地域生物的耐熱能力［16］。選用保守的HSP70 作為分子標(biāo)記來(lái)研究同種生物在不同溫度誘導(dǎo)下的表達(dá)變化規(guī)律，可以更好地認(rèn)識(shí)物種耐熱的機(jī)制。本研究中，克隆了寄生于草魚(yú)的多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因(Im HSP70)的開(kāi)放閱讀框(ORF)，并研究了在3種不同溫度下多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因在幼蟲(chóng)、滋養(yǎng)體和包囊3 個(gè)不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，旨在為從分子水平探討多子小瓜蟲(chóng)的溫度適應(yīng)機(jī)理提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多子小瓜蟲(chóng)來(lái)源 寄生有多子小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)Ctenopharynodon idellus 取自廣東省清遠(yuǎn)市某草魚(yú)苗種場(chǎng)，苗種場(chǎng)養(yǎng)殖水溫為(29 ±3)℃，草魚(yú)體長(zhǎng)為(8.5 ±0.53)cm，體質(zhì)量為(13.35 ±2.51)g。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后暫養(yǎng)于用活性碳除氯后的自來(lái)水中，水溫為(25 ±1)℃。

1.1.2 試驗(yàn)魚(yú) RR -B 系劍尾魚(yú)Xiphophorus hellerii 體長(zhǎng)為(5.64 ±0.41)cm，體質(zhì)量為(6.05±2.12)g，取自珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將108 尾試驗(yàn)魚(yú)平均分為9 組，暫養(yǎng)于9 個(gè)0.1 m3的小池中，暫養(yǎng)用水為除氯后的自來(lái)水，適應(yīng)5 d 后，再與寄生有多子小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)，在不同溫度(20 ±1)、(25 ±1)、(30 ±1)℃的水中混養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)中將12 尾劍尾魚(yú)和2 尾攜帶多子小瓜蟲(chóng)的草魚(yú)混養(yǎng)在一起。

1.2.2 不同溫度下多子小瓜蟲(chóng)成蟲(chóng)、包囊和幼蟲(chóng)的獲得 取被多子小瓜蟲(chóng)嚴(yán)重感染的劍尾魚(yú)(體表有很多的白點(diǎn))，輕輕刮魚(yú)體表面，將一定量的水連同多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體倒入培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，用吸管將集聚在中央的滋養(yǎng)體吸到另一個(gè)培養(yǎng)皿中，用蒸餾水反復(fù)清洗3次，直至除去大部分黏液。將滋養(yǎng)體移入裝有滅菌蒸餾水的離心管中，參照張其中等［5］的方法，將收集的滋養(yǎng)體分別在(20 ±1)、(25 ±1)、(30 ±1)℃恒溫中培育，形成包囊和孵化出幼蟲(chóng)。

1.2.3 總RNA 的提取及cDNA 的合成 分別將不同溫度下得到的多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體、幼蟲(chóng)和包囊富集于離心管底部，每個(gè)樣品加入1 mL 的TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，于-70 ℃下保存。參照TRIzol Reagent 說(shuō)明書(shū)對(duì)保存的樣品進(jìn)行總RNA的提取，用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的完整性，用分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，將高質(zhì)量的總RNA 于-70 ℃下保存?zhèn)溆?。? μg 總RNA，通過(guò)Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Roche，Germany)合成cDNA 第一鏈。分別將GenBank 中已報(bào)道的纖毛類(lèi)嗜熱四膜蟲(chóng)T.thermophila(GenBank:JQ697041)、螅狀獨(dú)縮蟲(chóng) Carchesium polypinum(GenBank:AY561304)HSP70 的mRNA 序列在多子小瓜蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)ImDB(www.ich.ciliate.org/blast/)中進(jìn)行Blast 比對(duì)，找到同源序列，再把獲得的序列通過(guò)NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進(jìn)行再次比對(duì)確認(rèn)，得到多子小瓜蟲(chóng)HSP70 的預(yù)測(cè)基因序列。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物F1、R1(表1)，用PCR 擴(kuò)增HSP70 基因的ORF，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)E.Z.N.A.TM Gel Extraction kit 試劑盒(Omega 公司)純化回收，連接到pGM -T18 載體(TaKaRa公司)中，轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取3 個(gè)陽(yáng)性克隆，送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析用Blast程 序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索。使用在線軟件SMART(http://smart.embl- heidelberg.de/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能域分析。經(jīng)Predictprotein(https://www.predictprotein.org/)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Swiss - model(http://swissmodel.expasy.org/)服務(wù)器預(yù)測(cè)3 -D 結(jié)構(gòu)。使用Clustal W軟件將克隆的多子小瓜蟲(chóng)及其他物種HSP70 基因的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，用Mega 4.1 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 熒光定量RT -PCR 利用Beacon Designer 8.0 軟件設(shè)計(jì)HSP70 特異引物F、R(表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，以18S RNA 作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物為IMR - F1、IMR - R1［4］(表1)，用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)各基因在各樣品中的表達(dá)量。反應(yīng)體系(20 μL):10 μL SYBR?Premix Ex TapTM(TaKaRa 公司)，0.4 μL ROX Reference Dye(TaKaRa 公司)，引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序:95 ℃下預(yù)變性10 min;95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán);最后在95 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)30 s，95 ℃下反應(yīng)15 s。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequences of primers used in this experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

以各溫度下幼蟲(chóng)、滋養(yǎng)體和包囊的cDNA 為樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀7300 測(cè)定目的基因的豐度，應(yīng)用2-△△CT分析方法，通過(guò)ABI7300 系統(tǒng)初步統(tǒng)計(jì)，用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因ORF 序列分析

以多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體cDNA 為模板，采用引物F1和R1，PCR 擴(kuò)增得到一條1995 bp 的條帶，符合預(yù)期大小。經(jīng)Blast 比對(duì)及ORF 分析后，確認(rèn)該序列為多子小瓜蟲(chóng)HSP70 其因的ORF(GenBank登錄號(hào):KF626379);將其與多子小瓜蟲(chóng)基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Im HSP70 無(wú)內(nèi)含子，ORF 全長(zhǎng)為1995 bp，預(yù)測(cè)編碼為664 個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為72 510，等電點(diǎn)為5.42。正電荷殘基(Arg+Lys)85 個(gè)，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)112個(gè)，整個(gè)蛋白質(zhì)帶-27 價(jià)電荷，為膜外蛋白。

經(jīng)Predictprotein 分析，Im HSP70 的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α- 螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主(圖1);經(jīng)Swiss -model 及SMART 分析，Im HSP70 蛋白的空間結(jié)構(gòu)在N 端含有一個(gè)高度保守的ATP 酶功能域，在C 端含有一個(gè)高度保守的多肽結(jié)合功能域(圖2、圖3)。

圖1 Im HSP70 蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.1 The deduced secondary structure of the HSP70 from Ichthyophthirius multifiliis

圖2 Im HSP70 蛋白分子功能域預(yù)測(cè)圖Fig.2 The deduced domains of the HSP70 from I.multifiliis

圖3 Im HSP70 蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.3 Tertiary structure of the deduced HSP70 from I.multifiliis

2.2 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將得到的氨基酸序列與GenBank 中其他寄生蟲(chóng)比較，并通過(guò)軟件Clustal W 計(jì)算同源性。結(jié)果顯示，Im HSP70 與其他物種的相似性為54.94% ～78.08%(表2)，其中與螅狀獨(dú)縮蟲(chóng)相似性最高(78.08%)。將上述比對(duì)結(jié)果采用NJ 法重復(fù)1000次構(gòu)建bootstrap 驗(yàn)證的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。結(jié)果顯示:哺乳類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)聚為一個(gè)分支;無(wú)脊椎動(dòng)物果蠅(NP_ 731651)、旋毛形線蟲(chóng)(AAO63753)等聚為另外一個(gè)分支;纖毛類(lèi)的螅狀獨(dú)縮蟲(chóng)(AAS68531)、多子小瓜蟲(chóng)(Im HSP70)、嗜熱四膜蟲(chóng)(AAK29100)、變蘚棘毛蟲(chóng)(AED86994)聚為一個(gè)分支。

表2 Im HSP70 氨基酸序列與其他物種的相似性Tab.2 Identity of HSP70 amino acid in Ichthyophthirius multifiliis with other species

2.3 不同溫度下Im HSP70 mRNA在不同發(fā)育階段相對(duì)表達(dá)水平的比較

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法，分析溫度為20、25、30 ℃時(shí)多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因在3 個(gè)不同發(fā)育階段(幼蟲(chóng)、滋養(yǎng)體和包囊)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:20 ℃和25 ℃時(shí)，Im HSP70 基因在滋養(yǎng)體中的表達(dá)量最高，且顯著高于其他兩個(gè)階段(P＜0.05)，包囊中表達(dá)量次之，幼蟲(chóng)中表達(dá)量最低;30 ℃時(shí)，Im HSP70 基因在包囊中的表達(dá)量最高，且顯著高于其他兩個(gè)階段(P＜0.05)，滋養(yǎng)體中次之，幼蟲(chóng)中最低(圖5)。3 個(gè)發(fā)育階段中，表達(dá)量最大的是25 ℃時(shí)滋養(yǎng)體，分別是25 ℃時(shí)幼蟲(chóng)、包囊中表達(dá)量的179 倍和54 倍。

分別對(duì)多子小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)、滋養(yǎng)體和包囊在20、25和30 ℃時(shí)的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明:幼蟲(chóng)中HSP70 基因在30 ℃時(shí)表達(dá)略有增強(qiáng)(P ＞0.05)，分別是25 ℃和20 ℃時(shí)的1.75 倍和1.28倍;滋養(yǎng)體中HSP70 的表達(dá)量在25 ℃時(shí)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，在30 ℃時(shí)又顯著降低(P＜0.05)，呈先升后降的變化趨勢(shì);包囊中HSP70 的表達(dá)量呈先降后升的變化趨勢(shì)，在25 ℃時(shí)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，30 ℃時(shí)表達(dá)量又顯著升高(P＜0.05)。

圖4 Im HSP70 與其他物種HSP70 基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of HSP70 from I.multifiliis and other species

圖5 小瓜蟲(chóng)不同發(fā)育階段HSP70 mRNA在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of Im HSP70 mRNA in different stages of I.multifiliis at different temperature

3 討論

3.1 多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因序列與結(jié)構(gòu)特征

有研究表明，HSP70可能是寄生蟲(chóng)-宿主相互作用的一個(gè)重要的分子［25］。HSP70 的存在，可以促進(jìn)感染的宿主細(xì)胞成為自然殺傷細(xì)胞(NK -cell)介導(dǎo)毒性的靶細(xì)胞［26］。HSP70 家族中，共有21種蛋白質(zhì)，主要包括誘導(dǎo)型HSP70、熱激同源蛋白70(heat shock cognate 70，HSC70)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75等［27］，其中誘導(dǎo)型HSP70 基因的一個(gè)顯著特征是不含內(nèi)含子［28］。用本研究中克隆得到的多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因的ORF 與多子小瓜蟲(chóng)基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因不含內(nèi)含子，克隆出來(lái)的可能屬于誘導(dǎo)型HSP70 基因。馮立芳等［17］克隆出嗜熱四膜蟲(chóng)的HSP70 基因，明建華等［29］克隆出團(tuán)頭魴的HSP70 基因，均驗(yàn)證了這個(gè)特征。Im HSP70 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和β -折疊為主，這與脊椎動(dòng)物的HSP70 相似［30］。同源性分析表明，多子小瓜蟲(chóng)HSP70 與其他原生動(dòng)物HSP70 的氨基酸序列相似性高，與同為纖毛門(mén)的螅狀獨(dú)縮蟲(chóng)、嗜熱四膜蟲(chóng)、變蘚棘毛蟲(chóng)聚在一個(gè)分支上，而與哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)等相距甚遠(yuǎn)，說(shuō)明根據(jù)HSP70 序列分析的結(jié)果與傳統(tǒng)的分類(lèi)結(jié)果是一致的。而馮立芳等［17］克隆出嗜熱四膜蟲(chóng)的5 個(gè)HSP70，編碼序列各不相同。Raphaela等［31］分析發(fā)現(xiàn)，HSP70 家族中有著不同的基因型成員，說(shuō)明HSP70 具有多態(tài)性，而且在功能上也是有差異的。多子小瓜蟲(chóng)HSP70是否存在其他的類(lèi)型，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 多子小瓜蟲(chóng)HSP70 基因表達(dá)與發(fā)育、溫度的相關(guān)性

多數(shù)寄生蟲(chóng)生活史復(fù)雜，具有不同的發(fā)育階段。HSP70 基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量是否有差異，也是揭示寄生蟲(chóng)抵抗不同環(huán)境條件而生存的關(guān)鍵。前人的研究表明，在寄生蟲(chóng)的不同發(fā)育階段，HSP70 的表達(dá)存在差異。del Cacho等［32］對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Eimeria tenella 的研究發(fā)現(xiàn)，在球蟲(chóng)的發(fā)育、成熟和入侵過(guò)程中，孢子生殖階段的HSP70表達(dá)量呈遞增水平，利用HSP70 的特異性單克隆抗體通過(guò)免疫組化等技術(shù)分析顯示，HSP70表達(dá)于孢子形成階段;HSP70 出現(xiàn)在早期感染階段可能與蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)受到的應(yīng)激有關(guān)，也可能與子孢子的形成有關(guān)。Neumann等［33］對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)Schistosoma mansoni在不同發(fā)育階段的HSP70 研究發(fā)現(xiàn)，HSP70 只表達(dá)于胞蚴、童蟲(chóng)和成蟲(chóng)，在尾蚴中不表達(dá)，在胞蚴和尾蚴的轉(zhuǎn)型期HSP70 轉(zhuǎn)錄終止;但尾蚴轉(zhuǎn)化為童蟲(chóng)和成蟲(chóng)受42 ℃熱應(yīng)激處理后，HSP70表達(dá)升高，6 h 達(dá)到最高水平。馮立芳等［17］的研究也發(fā)現(xiàn)，嗜熱四膜蟲(chóng)在生長(zhǎng)、饑餓和接合生殖等生理或發(fā)育狀態(tài)下，HSP70 的表達(dá)量也是不同的。與其結(jié)果相似的是，本研究中通過(guò)對(duì)3種不同溫度下，HSP70 mRNA在多子小瓜蟲(chóng)3 個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，在幼蟲(chóng)、包囊和成蟲(chóng)3 個(gè)發(fā)育階段，HSP70表達(dá)量有顯著的差異，而且在幼蟲(chóng)階段表達(dá)量最低。Abernathy等［34］利用多子小瓜蟲(chóng)表達(dá)序列標(biāo)簽信息比較發(fā)現(xiàn)，多子小瓜蟲(chóng)在幼蟲(chóng)、滋養(yǎng)體、包囊的轉(zhuǎn)錄因子包括抑動(dòng)抗原和表質(zhì)蛋白均表達(dá)不同。Yi等［35］發(fā)現(xiàn)，木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis和槐屬植物苦豆子Sophora alopecuroides 的甲醇提取物對(duì)小瓜蟲(chóng)幼蟲(chóng)有著很強(qiáng)的殺滅活性，且提取物對(duì)幼蟲(chóng)階段的毒力要顯著強(qiáng)于包囊階段;Ling等［36］也得出同樣的結(jié)論。本研究結(jié)果表明，多子小瓜蟲(chóng)HSP70在幼蟲(chóng)階段的表達(dá)量最低，可能與不同生活史階段有關(guān)。

多子小瓜蟲(chóng)對(duì)溫度的耐受性存在著明顯的差異，分為溫帶型和熱帶型［7］，溫帶型的適宜水溫為16 ℃，熱帶型的適宜水溫在16 ～24 ℃。馮立芳等［16］在研究螅狀獨(dú)縮蟲(chóng)的耐熱能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同緯度地域的螅狀獨(dú)縮蟲(chóng)，其HSP70 高表達(dá)的閥值也是不同的。本研究中，多子小瓜蟲(chóng)取自水溫為29 ℃下的感染草魚(yú)，這表明多子小瓜蟲(chóng)在29 ℃時(shí)仍對(duì)草魚(yú)具有致病性，故推測(cè)該多子小瓜蟲(chóng)為熱帶型。del Cacho等［37］對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)Eimeria tenella 野生株和2種早熟株的子孢子階段的HSP70表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，隨著蟲(chóng)株毒力的減弱其子孢子的HSP70表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì)，表明HSP70在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子中的表達(dá)與其致病性相關(guān)。HSP70在不同的生物中作為一種抗應(yīng)激相關(guān)因子，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，以合成表達(dá)HSP70 來(lái)提高自身的抵抗力。本研究中，劍尾魚(yú)在30 ℃水溫中仍能感染多子小瓜蟲(chóng)病，可能與多子小瓜蟲(chóng)高表達(dá)的HSP70 有一定的關(guān)系。隨著孵育溫度的升高，在滋養(yǎng)體中的表達(dá)量先上升后降低，在包囊中的表達(dá)量先降低后上升。多子小瓜蟲(chóng)受到熱刺激時(shí)，HSP70 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平隨之出現(xiàn)明顯的增加。而當(dāng)熱刺激超過(guò)HSP70 蛋白的耐受能力范圍時(shí)，高HSP70 的表達(dá)量可能反饋調(diào)節(jié)抑制HSP70 基因的表達(dá)［38］。多子小瓜蟲(chóng)的幼蟲(chóng)和包囊階段是生活在水體中，包囊的形成是多子小瓜蟲(chóng)對(duì)不良環(huán)境的一種很好的適應(yīng)性，而幼蟲(chóng)卻沒(méi)有這種保護(hù)機(jī)制，這也可能是包囊與幼蟲(chóng)HSP70表達(dá)量不同的原因之一。水溫30℃時(shí)，滋養(yǎng)體中HSP70 也有一定的表達(dá)量，說(shuō)明在30 ℃時(shí)多子小瓜蟲(chóng)滋養(yǎng)體仍具有生物活性。而在包囊中HSP70表達(dá)量顯著高于滋養(yǎng)體和幼蟲(chóng)，說(shuō)明包囊的形成有利于抵抗高溫的環(huán)境。HSP70在包囊中的大量表達(dá)也許是多子小瓜蟲(chóng)病在大約30℃的高溫時(shí)仍能暴發(fā)的重要分子機(jī)制。因此，有必要對(duì)不同溫度型的多子小瓜蟲(chóng)在不同溫度下以及不同型HSP70在耐熱機(jī)制中的功能作進(jìn)一步探討。

［1］Wei J Z，Li H，Yu H.Ichthyophthiriasis:emphasis on the epizootiology［J］.Applied Microbiology，2013，57(2):91 -101.

［2］黃琪琰.水產(chǎn)動(dòng)物疾病學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1993:180 -193.

［3］Dickerson H，Clark T.Ichthyophthirius multifiliis:a model of cutaneous infection and immunity in fishes［J］.Immunol Reviews:Immune Systems of Ectothermic Vertebrates，1998，166(1):377 -384.

［4］Olivier J，Carlo P，Domenica D B，et al.Non - invasive detection and quantification of the parasitic ciliate Ichthyophthirius multifiliis by real time PCR［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2005，65(3):251 -255.

［5］張其中，張占會(huì)，陳達(dá)麗，等.水溫對(duì)多子小瓜蟲(chóng)的影響［J］.生態(tài)科學(xué)，2010，29(2):116 -120.

［6］Mojtaba A，Kurt B.Temperature - dependent protection against Ichthyophthirius multifiliis following immunization of rainbow trout using live theronts［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2006，72(3):269 -273.

［7］Price D J，Clayton M G.Genotype-environment interactions in the susceptibility of the common carp，Cyprinus carpio，to Ichthyophthirius multifiliis infections［J］.Aquaculture，1999，173(1/4):149 -160.

［8］戰(zhàn)文斌.水產(chǎn)動(dòng)物病害學(xué)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004:223 -233.

［9］Xu D H，Klesius P H，Shoemaker C A，et al.The early development of Ichthyophthirius multifiliis in channel catfish in vitro［J］.Journal of Aquatic Animal Health，2000，12:290 -296.

［10］Xu D H，Klesius P H.Two year study on the infectivity of Ichthyophthirius multifiliis in channel catfish Ictalurus punctatus［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2004，59:131 -134.

［11］Noe J G，Dickerson H W.Sustained growth of Ichthyophthirius multifiliis at low temperature in the laboratory［J］.Internation Journal for Parasitology，1995，81(6):1022 -1024.

［12］錢(qián)龍，艾濤，謝恒修.溫室培育烏鱧魚(yú)苗對(duì)小瓜蟲(chóng)病的防治［J］.中國(guó)水產(chǎn)，1999(10):33.

［13］鄧永強(qiáng)，汪開(kāi)毓，黃小麗.魚(yú)類(lèi)小瓜蟲(chóng)病的研究進(jìn)展［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(2):149 -153.

［14］陳愛(ài)平，江育林，錢(qián)冬，等.小瓜蟲(chóng)?。跩］.中國(guó)水產(chǎn)，2011(8):37 -38.

［15］梁長(zhǎng)輝.盛夏小瓜蟲(chóng)病的防治探討［J］.漁業(yè)致富指南，2011(10):11.

［16］馮立芳，繆偉.不同緯度螅狀獨(dú)縮蟲(chóng)耐熱能力及Hsp70 mRNA表達(dá)水平的比較［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，54(3):525 -530.

［17］馮立芳，暢悅，袁冬霞，等.嗜熱四膜蟲(chóng)五個(gè)Hsp70 基因的表達(dá)分析［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2011，32(3):267 -276.

［18］黃芬，何彰華，李存，等.熱激蛋白70 的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2011，22(6):883 -886.

［19］Beere H M，Wolf B B，Cain K，et al.Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome［J］.Nature Cell Biology，2000，2(8):469-475.

［20］Ravagnan L，Gurbuxani S，Susin S A，et al.Heat -shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor［J］.Nature Cell Biology，2001，3(9):839 -843.

［21］Kumar Y，Tatu U.Stress protein flux during recovery from simulated ischemia:induced heat shock protein 70 confers cytoprotection by suppressing JNK activation and inhibiting apoptotic cell death［J］.Proteomics，2003，3(4):513 -526.

［22］Zhao Z G，Shen W L.Heat shock protein 70 antisense oligonucleotide inhibits cell growth and induces apoptosis in human gastric cancer cell line SGC-7901［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，11(1):73 -78.

［23］Aruda A M，Baumgartner M F，Reitzel A M，et al.Heat shock protein expression during stress and diapause in the marine copepod Calanus finmarchicus［J］.Journal of Insect Physiology，2011，57(5):665 -675.

［24］韓燕，王淑紅，孟照俊，等.熱處理對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖、凋亡及HSP70表達(dá)的影響［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2011，40(4):394 -396.

［25］Yang J，Yang L L，Lv Z Y，et al.Molecular cloning and characterization of a HSP70 gene from Schistosoma japonicum［J］.Parasitology Research，2012，110(5):1785 -1793.

［26］Bottger E，Multhoff G，Kun J F，et al.Plasmodium falciparum -infected erythrocytes induce granzyme B by NK cells through expression of Host-Hsp70［J］.PLoS One，2012，7(2):1 -11.

［27］楊秉芬，孫啟鴻，曹誠(chéng).熱激蛋白70 研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2009，20(5):716 -719.

［28］Franzellitti S，F(xiàn)abbri E.Differential HSP70 gene expression in the Mediterranean mussel exposed to various stressors［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，336(4):1157 -1163.

［29］明建華，謝駿，劉波，等.團(tuán)頭魴HSP70 cDNA 的克隆、序列分析以及熱應(yīng)激對(duì)其mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2009，16(5):635 -648.

［30］田照輝，徐紹剛，王巍，等.西伯利亞鱘熱休克蛋白HSP70 cDNA 的克隆、序列分析和組織分布［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(2):150 -157.

［31］Raphaela de C G，Suely L G.Comparative expression analysis of members of the Hsp70 family in the chytridiomycete Blastocladiella emersonii［J］.Gene，2007，386(1):24 -34.

［32］del Cacho E，Gallego M，Pereboom D，et al.Eimeria tenella:hsp70 expression during sporogony［J］.J Parasitol，2001，87(5):946 -950.

［33］Neumann S，Ziv E，Lantner F，et al.Regulation of Hsp70 gene expression during the life cycle of the parasitic helminth Schistosoma mansoni［J］.European Journal of Biochemistry，1993，212(2):589 -596.

［34］Abernathy J，Xu D H，Peatman E，et al.Gene expression profiling of a fish parasite Ichthyophthirius multifiliis:insights into development and senescence-associated avirulence［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，Part D，2011，6(4):382 -392.

［35］Yi Y L，Lu C，Hu X G，et al.Antiprotozoal activity of medicinal plants against Ichthyophthirius multifiliis in goldfish(Carassius auratus)［J］.Parasitol Research，2012，111:1771 -1778.

［36］Ling F，Wang J G，Lu C，et al.Effects of aqueous extract of Capsicum frutescens(Solanaceae)against the fish ectoparasite Ichthyophthirius multifiliis［J］.Parasitol Research，2012，111:841 -848.

［37］del Cacho E，Gallego M，López - Bernad F，et al.Differences in Hsp70 expression in the sporozoites of the original strain and precocious lines of Eimeria tenella［J］.Parasitology，2005，91(5):1127 -1131.

［38］Kiang J G，Tsokos G C.Heat shock protein 70 kDa:molecular biology，biochemistry，and physiology［J］.Pharmacology ＆ Therapeutics，1998，80(2):183 -201.