張群英，豐浩榮，葛 偉，許鵬程

呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是機(jī)械通氣引起或者加重的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，常導(dǎo)致患者肺部原有病情加重甚至引發(fā)肺外多系統(tǒng)器官功能衰竭(MSOF)而死亡。目前，VILI的發(fā)病機(jī)理不清，早期診斷困難，治療缺少針對(duì)性，確診時(shí)常喪失救治時(shí)機(jī)，病死率居高不下［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究VILI的重要方法，本研究采用不同的潮氣量(VT)和通氣時(shí)間，來(lái)制作家兔VILI模型，為進(jìn)一步研究VILI發(fā)病機(jī)制及其防治措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重2．2～2．9 kg成年雄性清潔級(jí)家兔54只，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(蘇)2003-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與主要試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠，DH-150型)，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技公司，BL-420型)，血?dú)夥治鰞x(瑞氏AVL公司，compact 3型)，電熱恒溫干燥箱(上海精宏設(shè)備有限公司，DHG-9037型)，戊巴比妥鈉(上海拜力生物科技公司)，哌庫(kù)溴胺(成都諾迪康生物制藥公司)，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物準(zhǔn)備:耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉全身麻醉，備皮行氣管切開(kāi)置入氣管插管，連接呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，間斷給予哌庫(kù)溴胺維持肌松。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，插入動(dòng)脈導(dǎo)管連接生理監(jiān)護(hù)儀，持續(xù)監(jiān)測(cè)血壓、心率并進(jìn)行動(dòng)脈血采集。分離右側(cè)頸靜脈置入靜脈套管針用作靜脈通道，以10 ml/(kg·h)速度持續(xù)輸注生理鹽水，補(bǔ)充丟失的液體并維持血壓穩(wěn)定。通氣參數(shù)設(shè)置為容量控制(CMV):VT 10 ml/kg，吸入氧濃度(FiO2)21%，吸呼比(I∶E)1∶2，呼氣末正壓(PEEP)2 cmH2O(1 cmH2O=0．098 kPa)，呼吸頻率30～40/min，維持二氧化碳分壓(PaCO2)40 mmHg(1 mmHg=0．133 kPa)。

1.3.2 動(dòng)物分組:機(jī)械通氣穩(wěn)定30 min后記錄各項(xiàng)生理參數(shù)，為基礎(chǔ)值(時(shí)間點(diǎn)記為0 h)，將動(dòng)物隨機(jī)分為各實(shí)驗(yàn)組，予以不同VT和通氣時(shí)間，每亞組均為6只家兔。①小潮氣量組(VT10組):繼續(xù)初始通氣條件機(jī)械通氣，調(diào)節(jié)VT為10 ml/kg，呼吸頻率32/min，通氣時(shí)間分別為2 h，4 h，6 h(分別記為VT10-2亞組，VT10-4亞組，VT10-6亞組)。②中潮氣量組(VT20組):調(diào)節(jié)VT為20 ml/kg，呼吸頻率14/min，通氣時(shí)間分別為 2 h，4 h，6 h(分別記為VT20-2亞組，VT20-4亞組，VT20-6亞組)。③大潮氣量組(VT40組):調(diào)節(jié)VT為40 ml/kg，呼吸頻率8/min，通氣時(shí)間分別為 2 h，4 h，6 h(分別記為VT40-2亞組，VT40-4亞組，VT40-6亞組)。通氣過(guò)程中根據(jù)血?dú)馇闆r調(diào)整呼吸頻率以維持PaCO240 mmHg左右，除PEEP設(shè)為0 cmH2O外，余通氣參數(shù)與準(zhǔn)備階段相同。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) ①血流動(dòng)力學(xué):連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(MAP)、心率(HR)。②血?dú)夥治?每間隔2 h測(cè)定氧分壓(PaO2)、PaCO2、pH值等氣體交換和代謝指標(biāo)。③呼吸力學(xué):連續(xù)監(jiān)測(cè)氣道峰壓(Ppeak)、平臺(tái)壓(Pplat)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)放血處死動(dòng)物(未到終點(diǎn)時(shí)間即死亡的出組)。④BALF蛋白定量、有核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù):開(kāi)胸后以動(dòng)脈夾夾閉右主支氣管，以8 ml 4℃生理鹽水反復(fù)肺灌洗3次回收，再用8 ml生理鹽水灌洗一次回收，將兩次回收得到的BALF用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，4000 r/min離心15 min。細(xì)胞沉渣重新懸浮于1 ml生理鹽水，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞總數(shù)，并涂片瑞氏染色計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞。上清液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。⑤肺組織濕干比:選取左肺上葉稱濕重，置于80℃烤箱烘烤24 h稱干重，計(jì)算濕干比。⑥病理形態(tài)學(xué)觀察:留取左肺下葉組織適量，置入4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)包埋石蠟切片，HE染色光鏡下觀察肺損傷情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，Bartlett檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差分析中Dunnett方法進(jìn)行組間均數(shù)比較，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)及死亡率 各組動(dòng)物在麻醉后，均能保持麻醉狀態(tài)，具體臨床表現(xiàn)及死亡數(shù)見(jiàn)表1。

表1 9組呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型臨床表現(xiàn)及死亡率

2.2 血流動(dòng)力學(xué)及呼吸力學(xué)參數(shù) 各組動(dòng)物在通氣開(kāi)始時(shí)，MAP 為(103．2±7．3)mmHg，HR 為(204．9 ±17．4)/min，Ppeak 為(12．3 ±1．1)cmH2O，Pplat為(8．6 ±1．2)cmH2O，氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)為(465．5 ±24．2)mmHg。VT20、VT40 組內(nèi)隨著通氣時(shí)間的延長(zhǎng)，MAP及 HR呈不同程度下降，且VT40組較VT20組下降更明顯，甚至出現(xiàn)不同程度的缺氧、休克表現(xiàn)及死亡，見(jiàn)表2。

VT10組通氣過(guò)程中Ppeak相對(duì)穩(wěn)定，VT20組和VT40組在通氣過(guò)程中Ppeak呈基本上升趨勢(shì)，VT40組升高最為顯著，與VT10組和VT20組同時(shí)間點(diǎn)比較差異均具有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

VT10組在各時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2保持穩(wěn)定，與0 h比較均無(wú)顯著差異(P＞0．05)。VT20和 VT40兩組PaO2/FiO2隨通氣時(shí)間延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，其中VT20組的2 h后與0 h比較差異均有顯著性但PaO2/FiO2均 ＞300 mmHg，而4 h、6 h 點(diǎn) PaO2/FiO2均＜300 mmHg，VT40組通氣中不同時(shí)間點(diǎn)與0 h比較都有明顯下降(P＜0．05)，其中 2、4、6 h的PaO2/FiO2值均 ＜300 mmHg，見(jiàn)表2。

2.3 肺組織病理改變 VT10組肺組織肉眼及光鏡下未見(jiàn)明顯的改變。VT20組隨著通氣時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)一定程度的肺損傷，至通氣6 h時(shí)，大體標(biāo)本肉眼可見(jiàn)散在出血點(diǎn)，鏡下表現(xiàn)為肺間隔增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔少量滲出。而VT40組通氣2 h后肺組織就出現(xiàn)了顯著的損傷改變，大體標(biāo)本可見(jiàn)點(diǎn)、片狀出血，鏡下見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)變形、間隔增寬及肺泡腔融匯，大量滲出，炎性細(xì)胞大量積聚，部分肺組織實(shí)變。肺病理改變隨通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇。見(jiàn)圖1。

表2 9組呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型血流動(dòng)力學(xué)及呼吸力學(xué)參數(shù)比較(±s)

表2 9組呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型血流動(dòng)力學(xué)及呼吸力學(xué)參數(shù)比較(±s)

注:VT10-2、4、6:潮氣量為 10 ml/kg，通氣時(shí)間為 2、4、6 h;VT20-2、4、6:潮氣量為 20 ml/kg，通氣時(shí)間為 2、4、6 h;VT40-2、4、6:潮氣量為40 ml/kg，通氣時(shí)間為2、4、6 h;與VT10組相同通氣時(shí)間的亞組比較，a P＜0．05;與VT20組相同通氣時(shí)間的亞組比較，c P ＜0．05

組別 兔數(shù) 平均動(dòng)脈壓(mmHg)心率(/min)氣道峰壓(cmH2 O)氣道平臺(tái)壓(cmH2 O)氧合指數(shù)(mmHg)VT10-2 6 105．4 ±6．9 202．9 ±15．8 12．4 ±1．3 9．5 ±1．1 459．3 ±25．8 VT10-4 6 100．2 ±8．8 200．2 ±16．4 13．3 ±1．2 9．6 ±1．2 425．1 ±33．2 VT10-6 6 95．4 ±9．1 194．5 ±18．2 14．6 ±1．1 11．3 ±1．5 418．6 ±26．6 VT20-2 6 100．4 ±6．5 193．4 ±16．8 20．1 ±1．8a 16．3 ±2．1a 339．7 ±28．8a VT20-4 6 96．1 ±8．3 190．2 ±17．1 22．3 ±2．2a 18．4 ±1．9a 295．2 ±23．4a VT20-6 5 91．4 ±7．1 174．5 ±18．3 27．6 ±2．5a 19．7 ±2．3a 228．2 ±22．7a VT40-2 5 97．5 ±6．6 188．2 ±17．3 29．1 ±2．8ac 18．2 ±2．0a 279．3 ±25．1ac VT40-4 4 85．2 ±7．1a 167．5 ±16．3a 32．4 ±2．6ac 22．6 ±2．6ac 220．1 ±24．2ac VT40-6 3 78．4 ±7．4ac 154．8 ±17．6a 39．5 ±3．2ac 26．7 ±3．9ac 188．7 ±20．5 ac

圖1 呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型肺組織大體及肺組織病理學(xué)觀察(HE×100)

2.4 肺濕干比、BALF蛋白含量、有核細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組家兔的肺濕干比、BALF蛋白含量、有核細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均隨通氣時(shí)間延長(zhǎng)而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組具體見(jiàn)表3。雖部分結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但VT10-6、VT20-6、VT40-6亞組均顯著高于同組內(nèi)2 h亞組(P＜0．05)，VT40-6亞組顯著高于 VT40-4亞組(P＜0．05)。VT40-4亞組BALF蛋白含量、有核細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于VT10-4亞組及VT20-4亞組(P＜0．05)。隨潮氣量加大，部分相同通氣時(shí)間組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組具體見(jiàn)表3。

表3 9組呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型檢測(cè)指標(biāo)比較(±s)

表3 9組呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型檢測(cè)指標(biāo)比較(±s)

組別 例數(shù) 肺濕干比值BALF蛋白含量(g/L)有核細(xì)胞總數(shù)(×109/L)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)VT10-2 6 2．21±0．35 0．39±0．04 23．2±1．7 1．13±0．21 VT10-4 6 2．78±0．55 0．47±0．06a 25．2±2．2 1．44±0．19a VT10-6 6 3．77±0．75a 0．53±0．06a 27．2±2．7a 1．77±0．25a VT20-2 6 2．73±0．51 0．57±0．05c 34．6±3．7c 1．89±0．21c VT20-4 6 3．60±0．62ac 1．21±0．10ac 41．2±4．3ac 2．46±0．33ac VT20-6 5 4．00±0．67a 1．53±0．14ac 47．9±4．7ac 3．21±0．45ac VT40-2 5 3．54±0．76c 0．79±0．07ce 38．8±3．4ce 2．16±0．24ce VT40-4 4 4．32±0．78c 1．62±0．15ace 52．7±9．1ace 4．44±0．50ace VT40-6 3 4．94±0．78aceg 1．90±0．17aceg 61．2±9．6aceg 8．67±0．95 aceg

注:VT10-2、4、6:潮氣量為10 ml/kg，通氣時(shí)間為2、4、6 h;VT20-2、4、6:潮氣量為 20 ml/kg，通氣時(shí)間為 2、4、6 h;VT40-2、4、6:潮氣量為 40 ml/kg，通氣時(shí)間為 2、4、6 h;與同一潮氣量組內(nèi)2 h比較，aP＜0．05;與 VT10組相同通氣時(shí)間比較，cP ＜0．05;與 VT20 組相同通氣時(shí)間比較，eP ＜0．05;與VT40-4組比較，gP ＜0．05

3 討論

在臨床上機(jī)械通氣是危重患者救治過(guò)程中不可缺少的呼吸支持技術(shù)，ALI/ARDS是呼吸機(jī)使用的主要適應(yīng)證。然而，機(jī)械通氣如果使用不當(dāng)也可誘發(fā)或加重肺損傷，即引發(fā)VILI，其發(fā)生率高達(dá)15%，甚至引發(fā)肺外多系統(tǒng)器官功能衰竭(MSOF)［2-3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度通氣的機(jī)械牽張可導(dǎo)致肺組織生物傷，加重肺損傷。有學(xué)者證明，機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷是因高氣道壓和(或)高容量導(dǎo)致吸氣末肺組織過(guò)度擴(kuò)張和因呼氣末肺容積過(guò)低使不張的終末小氣道和肺泡隨機(jī)械通氣周期性地開(kāi)放和關(guān)閉所致的肺機(jī)械性損傷［4］。此外，在肺機(jī)械性損傷的基礎(chǔ)上肺內(nèi)炎性細(xì)胞聚集和炎癥遞質(zhì)釋放進(jìn)一步促進(jìn)了機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展［5］。因此，VILI表現(xiàn)形式多樣，不僅表現(xiàn)為肺泡外氣體，還包括肺泡上皮和血管內(nèi)皮的廣泛性破壞、肺水腫和肺不張等彌漫性肺損傷，在臨床上VILI的防治已受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。在臨床疾病的研究中，由于臨床病例資料(尤其是病理資料)收集存在一定的困難，故動(dòng)物模型在研究ALI中發(fā)揮著不可替代的重要作用，但同時(shí)動(dòng)物模型的復(fù)制也是ALI的研究的難點(diǎn)［6］。模型動(dòng)物的可選擇種類相當(dāng)廣泛，包括大鼠、小鼠、家兔、犬、豬、綿羊、山羊及靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。家兔機(jī)體抵抗力較弱，性格溫順易操作，能夠滿足一定的采血量，且成本適中［7］。

目前認(rèn)為大潮氣量合并無(wú)呼吸末正壓的通氣是復(fù)制VILI最簡(jiǎn)單和有效的方法［8］，致傷性通氣造成肺損傷的嚴(yán)重程度取決于機(jī)械應(yīng)力的強(qiáng)度和時(shí)間［8-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇不同VT機(jī)械通氣(VT10 ml/kg、20 ml/kg、40 ml/kg)、分別予不同通氣時(shí)間(2 h、4 h、6 h)，以期尋找一最佳的建立家兔VILI模型的通氣條件。研究表明［11-12］，正常家兔以 45 cmH2O的吸氣峰壓分別通氣5、10、20 min，動(dòng)物即可出現(xiàn)緊急致命的肺損傷。而相比之下，使用增加不大的VT通氣，造成的肺部損傷是隱匿而緩慢的，動(dòng)物能存活數(shù)小時(shí)至數(shù)天。由此可見(jiàn)，選擇適度的致傷性通氣方式是建立VILI模型的關(guān)鍵，致傷因素既不能引起動(dòng)物的急進(jìn)性死亡，又要在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)足以造成典型的肺損傷。

本研究以肺組織病理學(xué)作為評(píng)價(jià)肺損傷程度的客觀指標(biāo)，以PaO2/FiO2＜300 mmHg作為呼吸功能失代償判斷標(biāo)準(zhǔn)［13］，在實(shí)驗(yàn)中由于吸入氧濃度保持不變，故動(dòng)脈血PaO2的變化能間接反映肺功能的變化，結(jié)合其他相關(guān)肺損傷測(cè)定參數(shù)可綜合評(píng)價(jià)VILI模型建立的成功與否。目前認(rèn)為ALI/ARDS及VILI等均是由于損傷肺泡毛細(xì)血管膜導(dǎo)致的病理生理改變。故評(píng)價(jià)肺損傷的指標(biāo)集中于以上的機(jī)制及病理改變，包括肺水腫液的重量測(cè)量、肺順應(yīng)性、影像學(xué)、組織學(xué)評(píng)價(jià)、肺泡及血管的滲透性改變及BALF中蛋白、促炎因子及炎癥因子等，這些指標(biāo)均與肺損傷后病情的嚴(yán)重程度呈一定的正相關(guān)關(guān)系［14-16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:VT10組在各時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2保持穩(wěn)定，與0 h比較均無(wú)顯著差異。VT20和VT40組PaO2/FiO2隨通氣時(shí)間延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，其中VT20組通氣4 h、6 h后PaO2/FiO2均＜300 mmHg，VT40 組通氣后2 h、4 h、6h 的 PaO2/FiO2值均＜300 mmHg。VT10組肺組織肉眼及光鏡下未見(jiàn)明顯的改變。VT20組隨著通氣時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)一定程度的肺損傷，至通氣6 h時(shí)，大體標(biāo)本肉眼可見(jiàn)散在出血點(diǎn)，鏡下主要表現(xiàn)為肺間隔增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔少量滲出。而VT40組通氣2 h后肺組織就出現(xiàn)輕度損傷改變，通氣4 h損傷顯著，大體標(biāo)本可見(jiàn)點(diǎn)、片狀出血，鏡下見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)變形、間隔增寬及肺泡腔融匯，大量滲出，炎性細(xì)胞大量積聚，部分肺組織實(shí)變。這兩項(xiàng)指標(biāo)均充分說(shuō)明在VT為20 ml/kg下通氣6 h及40 ml/kg下通氣4 h、6 h均可造模成功，相應(yīng)的肺濕干比，BALF蛋白含量及BALF有核細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)這幾個(gè)指標(biāo)結(jié)果均可驗(yàn)證。

總之，綜合動(dòng)物死亡率、造模成本、病理切片效果等考慮，應(yīng)該認(rèn)為以VT40 ml/kg通氣4 h為成功復(fù)制病變典型的呼吸機(jī)所致肺損傷家兔模型的最佳條件。

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