盧 凡，趙連友，張志敏，鄒 青，玉小路，衛(wèi)聰穎，李 雪，丁 璐

伴有高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥的原發(fā)性高血壓為H型高血壓［1］。我國(guó)成年高血壓患者伴有高 Hcy血癥者約占75．5%［2］。Graham等［3］證實(shí)，H型高血壓患者心血管事件發(fā)生率較單純存在高血壓的患者高出約5倍，較正常人高出約25～30倍，還確證H型高血壓患者的兩種危險(xiǎn)因素高血壓和高Hcy血癥在導(dǎo)致心腦血管事件上存在明顯的協(xié)同作用。以往研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓初期，可以引起血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)和半胱氨酸門冬氨酸特異性蛋白酶12(caspase-12)等的表達(dá)增加，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，血管平滑肌細(xì)胞肥大凋亡，血管壁增厚，最終引起動(dòng)脈血管的重構(gòu)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，高Hcy也可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和分化，使血管內(nèi)膜中層增厚［4］，但其是否可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑加重高血壓血管重構(gòu)，有待進(jìn)一步研究。馬來(lái)酸依那普利葉酸片是全球第一個(gè)批準(zhǔn)用于治療Hcy

升高和伴有Hcy升高高血壓的藥物［5］，但其發(fā)揮功能的具體分子機(jī)制目前尚未見(jiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建造H型高血壓大鼠模型，觀察ERS相關(guān)因子GRP94和caspase-12表達(dá)的變化，并探討馬來(lái)酸依那普利葉酸片對(duì)H型高血壓大鼠血管重構(gòu)的抑制作用，旨在為H型高血壓所致的血管重構(gòu)提供理論依據(jù)，為馬來(lái)酸依那普利葉酸片的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 成年自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠，雄性，36只，體質(zhì)量200～240 g，鼠齡8～10周(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。兔抗大鼠GRP94抗體及兔抗大鼠caspase-12抗體(美國(guó)Abcam公司)，堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)Santacruz公司)。蛋氨酸(Sigma公司)，馬來(lái)酸依那普利葉酸片、Hcy檢測(cè)試劑盒及AUSA 340ⅡHcy檢測(cè)儀(深圳奧康制藥有限公司)。濃縮型二氨聯(lián)苯胺(DAB)檢測(cè)試劑盒(上海研晶生物科技有限公司)。BX41型光學(xué)顯微鏡及DP71型顯微攝像系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，Image ProPlus 6．0圖像分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)，RM6280型多道智能生理記錄及分析處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:將36只SHR大鼠隨機(jī)分3組，每組12只。依葉片組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予馬來(lái)酸依那普利葉酸片粉劑20 mg/(kg·d)雙蒸水灌胃。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予等量雙蒸水灌胃，蛋氨酸組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予等量雙蒸水灌胃。

1.2.2 血清Hcy濃度的測(cè)定:8周后抽取下腔靜脈血2 ml，室溫下靜置30 min，3000 r/min離心10 min后取上清液，存于EP管后置于－80℃冰箱保存待測(cè)。集中測(cè)定前將標(biāo)本置于冷水中復(fù)溶，AP90Hcy檢測(cè)試劑盒恢復(fù)至室溫，按Hcy檢測(cè)試劑盒(速率法)說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 平均動(dòng)脈壓(MAP)的測(cè)量及標(biāo)本的采集:稱量大鼠體質(zhì)量、腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(0.2 ml/50 g)使其麻醉，將麻醉好的大鼠于仰臥位固定于鼠臺(tái)，頸部剪毛，酒精、碘酒消毒處理，于頸前正中切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈后結(jié)扎其遠(yuǎn)端，并在血管壁上向心做“V”型切口，將內(nèi)充1%肝素生理鹽水的測(cè)壓導(dǎo)管插入至升主動(dòng)脈。穩(wěn)定10 min后，記錄其動(dòng)脈收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)。MAP=［DBP+1/3(SBP-DBP)］。記錄血壓后，快速開(kāi)胸，切取長(zhǎng)度約1.0 cm的胸主動(dòng)脈，PBS沖洗，以多聚甲醛(40 g/L)固定，石蠟包埋。

1.2.4 主動(dòng)脈中層厚度的測(cè)量:每個(gè)胸主動(dòng)脈石蠟切片各選取5張，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，利用Image-proplus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量大鼠主動(dòng)脈中層的厚度，取其平均值。

1.2.5 主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中GRP94和caspase-12的表達(dá):留取標(biāo)本切片(片厚5μm)，進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)。①GRP94檢測(cè)主要步驟:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加3%H2O2處理10 min，在微波爐中用枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 6.0)熱修復(fù)組織抗原15 min，冷卻后用PBS洗滌。滴加5%的BSA封閉液室溫20 min封閉后，依次分別滴加1∶100小鼠抗大鼠GRP94抗體(4℃過(guò)夜，PBS洗滌)、生物素化羊抗兔IgG(37℃孵育30 min，PBS洗滌)及 SABC(37℃孵育20 min，PBS洗滌)。加DAB顯色后，再滴加蘇木素輕度復(fù)染，依次經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察結(jié)果。②caspase-12檢測(cè)同上。

2 結(jié)果

2.1 血清Hcy值比較 喂養(yǎng)8周后，蛋氨酸組Hcy水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);依葉片組的Hcy水平明顯降低，與蛋氨酸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。見(jiàn)表1。

2.2 MAP的比較 喂養(yǎng)8周后，蛋氨酸組和對(duì)照組的MAP比較無(wú)顯著差異(P＞0．05);依葉片干預(yù)后大鼠MAP明顯降低，與蛋氨酸組相比較，差異顯著(P ＜0．05)。見(jiàn)表1。

2.3 主動(dòng)脈中層厚度比較 喂養(yǎng)8周后，蛋氨酸組與對(duì)照組相比，動(dòng)脈中層厚度增加，兩者之間有明顯的差異(P＜0．05);用依葉片干預(yù)以后，與蛋氨酸組比較，動(dòng)脈中層厚度降低，差異顯著(P＜0．05)。見(jiàn)表1。

2.4 各組大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中GRP94免疫組化的表達(dá)的變化 GRP94表達(dá)主要位于胞質(zhì)中，染色成棕黃色顆粒。蛋氨酸組大鼠血管平滑肌細(xì)胞CRP94表達(dá)較對(duì)照組增高更為顯著(P＜0．05);用依葉片干預(yù)后，與蛋氨酸組比較CRP94表達(dá)水平明顯減低(P ＜0．05)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 3組大鼠血管平滑肌中GRP94的免疫組化檢測(cè)(DAB×400)

表1 3組大鼠平均動(dòng)脈壓、同型半胱氨酸、主動(dòng)脈中層厚度的比較(±s)

表1 3組大鼠平均動(dòng)脈壓、同型半胱氨酸、主動(dòng)脈中層厚度的比較(±s)

注:對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予雙蒸水灌胃，蛋氨酸組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予雙蒸水灌胃，依葉片組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予馬來(lái)酸依那普利葉酸片粉劑20 mg/(kg·d)雙蒸水灌胃。與對(duì)照組比較，a P ＜0．05，b P ＜0．01;與蛋氨酸組比較，c P ＜0．05，d P ＜0．01

?

2.5 各組大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中caspase-12免疫組化的表達(dá)的變化 caspase-12表達(dá)主要位于胞質(zhì)中，染色成棕黃色顆粒。蛋氨酸組與對(duì)照組相比caspase-12蛋白的表達(dá)量顯著增加(P＜0．05);依葉片干預(yù)后，與蛋氨酸組比較caspase-12蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0．05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 3組大鼠血管平滑肌中caspase-12的免疫組化檢測(cè)(DAB×400)

表2 3組大鼠血管平滑肌細(xì)胞中GRP94、caspase-12的表達(dá)變化(±s)

表2 3組大鼠血管平滑肌細(xì)胞中GRP94、caspase-12的表達(dá)變化(±s)

注:對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予雙蒸水灌胃，蛋氨酸組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予雙蒸水灌胃，依葉片組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養(yǎng)同時(shí)給予馬來(lái)酸依那普利葉酸片粉劑20 mg/(kg·d)雙蒸水灌胃。與對(duì)照組比較，a P ＜0．05;與蛋氨酸比較，c P ＜0．05

組別 只數(shù)GRP94 caspase-12對(duì)照組12 0．49 ±0．008 0．51 ±0．012蛋氨酸組 12 0．71 ±0．021a 0．73 ±0．019a依葉片組 12 0．32 ±0．015c 0．38 ±0．009 c

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，是人體蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物。我國(guó)是一個(gè)高血壓大國(guó)，高血壓人口接近2億，其中3/4的高血壓患者伴有高Hcy血癥。大量研究證實(shí)［6］，高血壓和血漿Hcy水平升高在導(dǎo)致心腦血管事件上具有協(xié)同作用，使心血管疾病死亡危險(xiǎn)性增加4～6倍。血漿Hcy與高血壓血管重構(gòu)之間有何關(guān)系，目前尚不清楚。因此，血漿Hcy與高血壓的關(guān)系已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)課題。本研究通過(guò)建立高Hcy高血壓大鼠模型，探討了Hcy對(duì)高血壓大鼠血管主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞ERS分子伴侶GRP94、caspase-12表達(dá)變化，動(dòng)脈中層厚度及對(duì)血管重構(gòu)的影響。

Baumbac等［7-8］報(bào)道高Hcy血癥可引起高血壓血管內(nèi)皮功能損傷加重、血管平滑肌細(xì)胞肥大增生明顯及加重血管的重構(gòu);Tyagi［9］曾報(bào)道，Hcy能明顯刺激高血壓血管平滑肌細(xì)胞肥大增殖，加速血管重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用含2%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)SHR大鼠，成功建立高血壓伴高Hcy血癥大鼠模型，血清Hcy濃度可高達(dá)86μmol/L。研究顯示，蛋氨酸組與對(duì)照組相比，兩組MAP均＞160 mmHg，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;蛋氨酸組血清Hcy濃度水平比對(duì)照組顯著升高，差異明顯;蛋氨酸組與對(duì)照組相比主動(dòng)脈中層厚度顯著增加。提示高Hcy能加重動(dòng)脈血管增厚，從而加重高血壓引起的血管重構(gòu)，與上述報(bào)道一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)途徑是新近發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路;近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［10-11］，參與了多種病理及生理過(guò)程，與心血管疾病的關(guān)系極為密切。ERS初期引起血管動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中ER分子伴侶GRP78、GRP94等上調(diào)，促進(jìn)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白降解來(lái)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力［12］，維持細(xì)胞狀態(tài)的穩(wěn)態(tài)［13］，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。但是過(guò)強(qiáng)或者長(zhǎng)時(shí)間的ERS，超過(guò)細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)能力，反而激活促凋亡因子caspase-12、CHOP/GADD153等表達(dá)，引起細(xì)胞代謝紊亂［14-15］，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。高血壓通過(guò)ERS途徑參與了血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。是否高Hcy也對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ERS途徑產(chǎn)生影響，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，蛋氨酸組 GRP94和caspase-12的表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明Hcy參與了動(dòng)脈血管平滑肌ERS過(guò)程;蛋氨酸組與對(duì)照組比較GRP94和caspase-12的表達(dá)量更加顯著，說(shuō)明Hcy和高血壓的雙重因素對(duì)血管平滑肌的損傷作用顯著大于單純高血壓對(duì)血管的損傷;Hcy可以加重高血壓血管平滑肌的損傷，導(dǎo)致血管重構(gòu)的加重。ERS可能為H型高血壓雙因素(高Hcy和高血壓)協(xié)同作用的分子機(jī)制。

馬來(lái)酸依那普利葉酸片是我國(guó)自主研發(fā)的復(fù)方制劑，馬來(lái)酸依那普利片是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，具有良好的降壓效果;葉酸屬于B族維生素，能夠促進(jìn)Hcy甲基化，降低血漿Hcy;兩者合用在降壓的同時(shí)明顯降低Hcy濃度，對(duì)于H型高血壓具有雙重治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，固定配方中高葉酸劑量組較自由聯(lián)合方案中高葉酸劑量組降低Hcy相對(duì)有效率提高10%，降壓或降Hcy相對(duì)有效率提高22%［17］。本實(shí)驗(yàn)中，依葉片組與蛋氨酸組相比較，不僅降低了Hcy濃度和MAP，同時(shí)也使GRP94和caspase-12表達(dá)顯著降低，使血管壁中層增厚顯著降低，表明依葉片可能通過(guò)抑制H型高血壓血管平滑肌ERS途徑來(lái)逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)。

綜上所述，Hcy可能通過(guò)ERS途徑參與并加重高血壓引起的血管平滑肌重構(gòu)的過(guò)程。依葉片雙重治療作用使得高血壓及Hcy得到有效控制，可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)應(yīng)激來(lái)保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞，改善血管重構(gòu)。但是否還有其他信號(hào)分子、信號(hào)通路參與有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為馬來(lái)酸依那普利片治療H型高血壓提供了臨床應(yīng)用的理論依據(jù)。

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