高榮敏，馬慧萍，李 倩，李 琳，賈正平

高原缺氧對高原人群的身體健康危害極大，影響機體各種氧化代謝，最終導(dǎo)致心、腦等重要臟器因供氧不足而產(chǎn)生高原腦水腫、高原性心臟病等急性高原病(acute mountain sickness，AMS)，而這些疾病的始動因子是內(nèi)皮細(xì)胞的紊亂。大量研究表明內(nèi)皮細(xì)胞間是有緊密連接的，大血管中動脈的內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，靜脈的則較弱，細(xì)胞間的連接通過復(fù)雜的黏附結(jié)構(gòu)組成，如縫隙連接蛋白等，缺氧時縫隙連接蛋白重分布，致使血管通透性發(fā)生了改變［1］。

內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有強效提高血管通透性的作用，比組織胺強5000倍［2］，還能促進內(nèi)皮細(xì)胞增生，誘發(fā)新血管形成。由于VEGF具有誘導(dǎo)血管發(fā)生的潛能和對內(nèi)皮細(xì)胞的特異性，被認(rèn)為是主要的血管發(fā)生蛋白。本文旨在探討VEGF在模擬高原缺氧小鼠模型腦及心肌組織中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，7周，購自蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科，生產(chǎn)許可證編號:SYXK(軍)2012-0020，飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科，實驗期間提供足夠的食物和水，小鼠正常飲食。

1.2 儀器與試劑 FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業(yè)貴州雷航空軍械有限責(zé)任公司);高速離心機(德國Appendorf公司);水浴鍋(上海醫(yī)療器械七廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);TB-718E型生物組織自動包埋機(湖北泰雅電子技術(shù)有限公司);冷凍切片機、ZT-12J1生物組織自動脫水機、生物組織攤烤片機均購于湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司;多抗Rabbit polyclonalto VEGF ab46154，購于 abcam;抗體稀釋液購自武漢博士得生物工程有限公司;SABC免疫組化試劑盒(SA1022兔IgG-1/2KIT，武漢博士得生物工程有限公司);DAB顯色液(武漢博士得生物工程有限公司);PBS磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液均購于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬海拔8000 m急性高原缺氧實驗:取SPF級健康雄性BALB/c小鼠70只，飼養(yǎng)適應(yīng)3 d后隨機分成正常對照組，缺氧6 h組、9 h組、12 h組、24 h組、2 d組、3 d組，每組10只。正常對照組小鼠不缺氧，將其余各組小鼠放入低壓低氧動物實驗艙模擬8000 m海拔缺氧環(huán)境。減壓時以10 m/s的速度升至8000 m海拔，維持各組缺氧時間，完成減壓缺氧后于10 min內(nèi)快速放氣使艙內(nèi)氣壓與外界大氣壓相同。小鼠完成減壓后立即脫臼處死，并根據(jù)不同實驗?zāi)康膶Υ竽X和心臟進行相應(yīng)處理。

1.3.2 腦組織和心肌組織病理觀察:取各組小鼠的腦組織標(biāo)本和心肌組織標(biāo)本，生理鹽水洗凈血液后立即浸入10%甲醛中浸泡。樣品送至蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科，進行石蠟包埋、組織切片、染色以及觀察。

1.3.3 腦和心肌組織VEGF的表達水平:應(yīng)用免疫組化檢測模擬高原缺氧小鼠腦和心肌組織VEGF的表達水平，操作如下:①分別取各組小鼠的腦組織海馬區(qū)標(biāo)本及心肌組織標(biāo)本，石蠟切片放至烘箱;②脫蠟至水;③3%H2O2滅活內(nèi)源性酶;④熱修復(fù)抗原;⑤滴加BSA封閉液;⑥滴加一抗，濃度稀釋一抗1∶150;⑦滴加二抗;⑧滴加SABC;⑨DAB顯色(顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配)，鏡下控制反應(yīng)時間;⑩蘇木素輕度復(fù)染，封化。

每張切片隨機選取3個200倍視野，背景為紫藍色，VEGF在胞質(zhì)表達，陽性胞核呈藍色，胞質(zhì)著棕黃色，顏色深淺和著色強弱表明VEGF表達水平的高低。參照 Hayashi等［3］標(biāo)準(zhǔn)，對 VEGF陽性表達強度行半定量評分，并按下列標(biāo)準(zhǔn)判斷:細(xì)胞未著色:0分;散在細(xì)胞著色(淺黃色):1分;彌漫性弱陽性著色(淺棕黃色):2分;彌漫性中等強度著色(棕黃色):3分;彌漫性強陽性著色(棕褐色):4分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，各組實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 腦組織病理結(jié)構(gòu)觀察 如圖1所示，光鏡下正常對照組腦組織細(xì)胞形態(tài)完好，結(jié)構(gòu)正常，血管清晰可見;缺氧6 h組與正常對照組比較，腦組織細(xì)胞核染色質(zhì)不均勻，呈空泡狀或網(wǎng)狀，腦組織間質(zhì)內(nèi)空泡狀結(jié)構(gòu)增多，血管周、神經(jīng)細(xì)胞周和膠質(zhì)細(xì)胞周間隙擴大;缺氧9 h組較缺氧6 h組稍加重，缺氧12 h組和缺氧24 h組形態(tài)學(xué)變化最為顯著，細(xì)胞核染色質(zhì)極度不均勻呈空泡狀或網(wǎng)狀，間質(zhì)內(nèi)空泡狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯增多且變大，血管周、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞周間隙明顯擴大;缺氧2 d組和缺氧3 d組較缺氧24 h組形態(tài)學(xué)變化較緩和。

2.2 心肌組織顯微結(jié)構(gòu)觀察 如圖2所示，光鏡下正常對照組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，組織結(jié)構(gòu)正常;與正常對照組相比，缺氧6 h組可見肌組織充血，血管輕度擴張，部分細(xì)胞輕度腫脹，橫紋消失，結(jié)構(gòu)不清呈均質(zhì)狀，少量肌細(xì)胞核固縮深染;缺氧9 h組較缺氧6 h組以上形態(tài)學(xué)變化較明顯;缺氧12 h組和缺氧24 h組較缺氧9 h組肌纖維呈均質(zhì)狀及核固縮不明顯;缺氧2 d組和缺氧3 d組偶見肌纖維呈均質(zhì)狀及核固縮。

2.3 腦組織中VEGF蛋白的表達 與正常對照組相比，缺氧各組腦組織胞質(zhì)著色深，細(xì)胞陽性數(shù)量多，著色面積大。見圖3。對各組腦組織VEGF陽性表達強度行半定量評分，缺氧各組與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

圖1 7組小鼠腦組織病理切片(HE×200)

圖2 7組小鼠心肌組織病理切片(HE×200)

圖3 7組小鼠腦組織血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(HE×200)

2.4 心肌組織中VEGF蛋白的表達 與正常對照組比較，缺氧各組心肌組織胞質(zhì)著色深，著色面積大，見圖4。對各組心肌組織VEGF陽性表達強度行半定量評分，缺氧各組與正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

圖4 7組小鼠心肌組織血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(HE×200)

表1 7組小鼠腦、心肌組織VEGF陽性表達強度半定量評分(±s)

表1 7組小鼠腦、心肌組織VEGF陽性表達強度半定量評分(±s)

注:與正常對照組比較，b P＜0.01

分組 鼠數(shù) 腦組織 心肌組織缺氧6 h組 10 2.4±0.8b 2.6±0.5 b缺氧9 h組 10 3.2±0.6b 3.4±0.7b缺氧12 h組 10 3.4±0.7b 3.5±0.5b缺氧24 h組 10 3.6±0.5b 3.7±0.5b缺氧2 d組 10 3.7±0.7b 3.7±0.7b缺氧3 d組 10 3.8±0.4b 3.8±0.4b正常對照組10 0.6±0.1 0.3±0.1

3 討論

高原低氧環(huán)境嚴(yán)重?fù)p害腦、心、肺等對氧敏感的組織器官，易導(dǎo)致高原性心肌肥厚、高原腦水腫等。機體缺氧后，作為代償機制，易導(dǎo)致血管增生，VEGF是促血管增生，增加血管通透性的關(guān)鍵因子［4］。本實驗通過模擬高原缺氧環(huán)境，研究腦和心肌組織的形態(tài)學(xué)變化，并從蛋白水平研究VEGF的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧6 h組腦組織細(xì)胞核染色質(zhì)不均勻，呈空泡狀或網(wǎng)狀，腦組織間質(zhì)內(nèi)空泡狀結(jié)構(gòu)增多，血管周、神經(jīng)細(xì)胞周和膠質(zhì)細(xì)胞周間隙擴大;缺氧9 h組較缺氧6 h組稍加重，缺氧12 h組和缺氧24 h以上形態(tài)學(xué)變化最為顯著，缺氧2 d組和缺氧3 d組較缺氧24 h組以上形態(tài)學(xué)變化逐漸緩和。缺氧6 h組可見心肌組織輕度血管擴張充血，部分細(xì)胞輕度腫脹，橫紋消失結(jié)構(gòu)不清呈均質(zhì)狀，少量肌細(xì)胞核固縮深染;缺氧9 h組較缺氧6 h組以上形態(tài)學(xué)變化較明顯;缺氧12 h組和缺氧24 h組較缺氧9 h組肌纖維呈均質(zhì)狀及核固縮不明顯;2 d組和3 d組偶見肌纖維呈均質(zhì)狀及核固縮。本實驗結(jié)果表明缺氧會造成小鼠腦和心肌組織呈現(xiàn)病理性損傷，有水腫現(xiàn)象，且損傷程度與缺氧時間有關(guān)。

血管內(nèi)皮生長因子蛋白(VEGFs)是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的一種主要蛋白質(zhì)，以游離形式廣泛存在于機體各組織、器官，與其特異性受體構(gòu)成VEGF/VEGFR系統(tǒng)共同參與脈管內(nèi)皮細(xì)胞生理或病理狀態(tài)下的通透性變化、內(nèi)皮細(xì)胞的生長、存活和增殖、再生神經(jīng)元及血管重建［5-6］。冠狀血管形成需要多種信號分子及相關(guān)通路，通過代謝或應(yīng)激因素激活，缺氧會刺激缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、VEGF及其他因子的表達。一個部分血管叢穿透主動脈，主要由VEGF誘導(dǎo)，形成冠狀動脈口，它提供了解剖襯底的冠狀流，早期的增長的冠狀脈管系統(tǒng)由一個管狀網(wǎng)絡(luò)形成［7］。在缺氧-局部缺血狀態(tài)下，低氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子起到關(guān)鍵作用，如HIF及下游的VEGF、促紅細(xì)生成素等VEGF能促進毛細(xì)血管增生［8-10］。VEGF 表達受到炎癥、缺氧等因素調(diào)節(jié)［11］。Zhu等［12］發(fā)現(xiàn)在大腦缺血缺氧狀態(tài)下，VEGF能刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)生長因子的增生，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡。VEGF-A通過促血管生成因子MMP-9(間質(zhì)金屬蛋白酶)傳遞給中性粒細(xì)胞，從而誘導(dǎo)移植缺氧組織的血管生成［13］。Buroker等［14］研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A核苷酸多態(tài)性及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位與急性高原病有關(guān)。Hongge等［15］研究發(fā)現(xiàn)短耳野兔在高海拔地區(qū)VEGF189和VEGF165的表達會增加，并且海拔越高，增加越多。另有研究發(fā)現(xiàn)，將兔子中腦動脈閉塞2 h后，注入VEGF能減輕腦梗死及腦缺血缺氧狀態(tài)，并在一定濃度內(nèi)呈劑量依賴性［16］。Nural-Guvener等研究發(fā)現(xiàn)充血性心力衰竭后的大腦皮層和海馬區(qū)的VEGF表達增加。神經(jīng)炎癥發(fā)生在心肌梗死之后，此外，慢性充血性心力衰竭誘導(dǎo)的缺氧可能會上調(diào)VEGF的表達［17］，有研究表明P13K/Akt通路能夠調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子一氧化氮(NO)及抗血管生成因子的表達［18］，由 VEGF介導(dǎo)的信號途徑可能是通過P13K/Akt通路，抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶、鉀電流及增加了神經(jīng)細(xì)胞的增生有關(guān)［19］。VEGF信號機制對生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下的血管的新生的產(chǎn)生有著重要的影響，另有研究VEGF在不同條件下對組織物質(zhì)代謝的影響，從而為血管增生尋找新的靶點［20］。本實驗結(jié)果證明，缺氧小鼠腦和心肌組織中VEGF的表達升高，且隨缺氧時間的延長，表達顯著增加。

綜上所述，缺氧能造成小鼠腦和心肌組織損傷，呈現(xiàn)水腫的病理表現(xiàn)，并刺激VEGF分泌，導(dǎo)致新生血管形成。一方面，作為缺氧狀態(tài)下機體的代償機制，VEGF會增加;另一方面，VEGF能影響血腦屏障，其表達增加會導(dǎo)致血管通透性增加，血管內(nèi)液外滲，導(dǎo)致組織呈現(xiàn)水腫的病理性變化。VEGF適量升高，誘發(fā)新血管形成而不會引起腦、心等器官的病理變化，有利于提高機體對高原缺氧的適應(yīng)能力。因此，我們有望在VEGF因子上作進一步研究，通過干擾VEGF，使其適量表達，從而應(yīng)用其治療高原腦水腫、高原性心肌損傷等疾病。

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