朱 潔，周華東

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)具有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，在一定條件下能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞替代和組織修復(fù)功能［1-7］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)移植BMSCs具有向腦損傷病灶定向遷移的趨勢［8-12］，但其確切機(jī)制仍不明確，闡明其機(jī)制有助于采取積極手段促進(jìn)移植BMSCs向病灶遷移，提高移植治療效果。趨化因子fractalkine，是為數(shù)不多組成性的表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的趨化因子之一［13-14］。fractalkine和其唯一的受體CX3CR1相互作用，可通過提高細(xì)胞黏附和促進(jìn)CX3CR1陽性細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移在組織損傷中發(fā)揮作用［15-17］。

本課題組前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中fractalkine表達(dá)增高，可能參與介導(dǎo)靜脈移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stromal cells，hMSCs)向腦損傷區(qū)的定向遷移［18］。本研究利用Transwell小室建立體外遷移模型進(jìn)一步觀察fractalkine和其受體CX3CR1是否參與介導(dǎo)BMSCs向腦缺血組織的定向遷移，以此進(jìn)一步解釋移植BMSCs向腦損傷局部遷移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性SPF級SD大鼠，3～4月齡，體重270～300 g，以及2周齡SD大鼠幼鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。胎牛血清(FBS)購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?胰蛋白酶購自Amresco公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司;FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠 CD44、CD90、CD71、CD11b抗體、同型對照購自Serotec公司;重組大鼠fractalkine購自R＆D公司;CX3CR1抗體購自Abcam公司;SYBR Prime Script RT-PCR Kit購自TaKaRa公司;SP-9001免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Transwell小室聚碳酸酯膜(孔徑為8μm)購自BD Biosciences公司。

1.2 BMSCs的分離純化、培養(yǎng)及鑒定 2周齡大鼠幼鼠10只脫頸處死，無菌條件下分離雙側(cè)股骨，剪開干骺端，用注射器抽取0．01 mol/L PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液于 4℃、1000 r/min離心5 min共2次;棄上清后用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞接種到50 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次，10～14 d后傳代培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞約80% ～90%爬滿培養(yǎng)瓶底時(shí)用0．25%胰酶消化，按104/ml密度傳代接種。

用倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特征。取生長良好的第3～5代細(xì)胞，充分懸浮后制成單細(xì)胞懸液，以FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD44、CD90、CD71、CD11b 抗體室溫避光染色30 min，設(shè)立不加抗體的陰性對照;使用 Becton-Dickinson FAC Scan檢測，Apple公司隨機(jī)軟件分析，每個(gè)樣本分析10 000個(gè)細(xì)胞。

1.3 體外培養(yǎng)BMSCs表達(dá)CX3CR1的情況

1.3.1 RT-PCR檢測CX3CR1 mRNA表達(dá):取生長良好的第3～5代細(xì)胞，采用Tripure RNA抽提試劑提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)(Beckman Du 800)測定 RNA 純度及濃度，A260/280為1．8～2．0可用以實(shí)驗(yàn)。RNA統(tǒng)一定量為1．0μg后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。CX3CR1(140 bp)引物為:上游5'-AGCTGCTCAGGACCTCACCAT-3'，下游 5'-GTTGTGGAGGCCCTCATGGCTGAT-3';條件如下:42℃，30 min;95℃，5 min;5℃，5 min。待 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA后，以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在GENEGENUS數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)中觀察、拍照。

1.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測CX3CR1表達(dá):取生長旺盛的第3～5代細(xì)胞，以兔抗CX3CR1多克隆抗體(1∶200)，按照SP 9001試劑盒操作說明進(jìn)行SP 3步法免疫組化染色，以蘇木素染液復(fù)染核;陰性對照以0．1 mol/L PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.4 大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型的制備 參照Nagasawa線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型［19］(栓塞右側(cè)大腦中動脈)。術(shù)后2 h，拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注。動物蘇醒后參照Longa等方法進(jìn)行5分制評分［20］，2～3分者為實(shí)驗(yàn)對象。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。

1.5 腦組織勻漿上清液制備 正常對照組(正常對照組大鼠不做處理6只)及大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型大鼠(以再灌注不同時(shí)間24 h、72 h、7 d)各6只分別于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)斷頸處死，無菌條件下迅速摘取前腦(耳間線2～12 mm)，置冰上，迅速稱重，加入 DMEM培養(yǎng)基，勻漿，4℃以12 000 r/min，離心15 min，收集上清。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

1.6.1 不同濃度重組大鼠FKN對BMSCs遷移的影響:將PBS(正常對照組)及濃度分別為50、100、200、500 ng/ml重組大鼠fractalkine置于chamber下層，將2×105/ml BMSCs細(xì)胞懸液50μl(總細(xì)胞數(shù)104)于chamber上層，加入等量DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中，孵育18 h。取出Transwell小室用PBS洗2遍，于4℃體積分?jǐn)?shù)90%乙醇固定;加入結(jié)晶紫(0．1%)染色(5 ～10 min)，室溫 0．5 h，PBS 洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，40倍顯微鏡下觀察。每孔取中間和四周5個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)算染色細(xì)胞總數(shù)。

1.6.2 不同再灌注時(shí)間缺血大鼠腦組織萃取液對BMSCs遷移的影響:將正常大鼠腦組織(對照)及再灌注24 h、72 h、7 d MCAO大鼠腦組織萃取液置于chamber下層，將2×105/ml BMSCs細(xì)胞懸液50μl(總細(xì)胞數(shù) 104)置于 chamber上層，加入等量DMEM高糖培養(yǎng)基孵育18 h后計(jì)數(shù)遷移至濾膜下方的細(xì)胞數(shù)，每孔取中間和四周5個(gè)隨機(jī)視野。取最大黏附效應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 阻斷CX3CR1對BMSCs向缺血腦組織萃取液遷移的影響:阻斷組BMSCs于遷移誘導(dǎo)培養(yǎng)前預(yù)先以5μg/ml CX3CR1抗體于室溫下孵育30 min，將腦缺血大鼠腦組織萃取液置于chamber下層，將正常組及CX3CR1阻斷組2×105/ml BMSCs細(xì)胞懸液50μl(總細(xì)胞數(shù)104)置于chamber上層，加入等量DMEM高糖培養(yǎng)基孵育18 h后計(jì)數(shù)遷移至濾膜下方的細(xì)胞數(shù)，每孔取中間和四周5個(gè)隨機(jī)視野。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組均數(shù)比較，應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包行t檢驗(yàn)，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的分離純化及鑒定 第3～5代的BMSCs細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞呈極性排列，集落呈漩渦狀(圖1)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，BMSCs均一地表達(dá) CD44、CD90和 CD71，陽性率分別為98.4%、99．7%和99．6%;而CD11b 陽性率僅0.6%(圖2)。

圖1 相差顯微鏡觀察第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(×100)

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞儀分析圖

2.2 BMSCs CX3CR1 mRNA和蛋白的表達(dá) RTPCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:320 bp特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期趨化因子受體CX3CR1擴(kuò)增片段一致(圖3A)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)CX3CR1主要表達(dá)于BMSCs的胞膜和胞漿(圖3B)，空白對照未見陽性著色。

圖3 CX3CR1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)

2.3 fractalkine和缺血腦組織萃取液對BMSCs的定向趨化作用

2.3.1 不同濃度重組大鼠fractalkine對BMSCs遷移的影響:在重組 fractalkine濃度為50、100 ng/ml的作用下，遷移至下層chamber的BMSCs分別為(1．02 ±0．39)×103與(1．53 ±0．14)×103，和 PBS對照組(0．85±0．22)×103相比無明顯差異。而在200、500 ng/ml作用下，有較多量的BMSCs實(shí)現(xiàn)遷移，分別為(2．27 ±0．66)×103和(2．92 ±0．83)×103，與對照組相比有顯著差異(P＜0．05)。

2.3.2 不同再灌注時(shí)間缺血大鼠腦組織萃取液對BMSCs遷移的影響:與正常對照組相比，大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型組術(shù)后24 h大鼠腦組織萃取液所誘導(dǎo)的 BMSCs遷移(0．73±0．28)×103與正常對照組(0．52±0．08)×103相比未見顯著性差異(P＞0．05)。術(shù)后72 h和7 d大鼠腦組織萃取液所誘導(dǎo)的遷移 BMSCs分別為(1．39±0．33)×103和(1．74 ±0．31)×103，與正常對照組相比有顯著差異(P ＜0．05)。

2.3.3 阻斷CX3CR1對BMSCs向缺血腦組織萃取液遷移的影響:以CX3CR1抗體阻斷BMSCs向缺血腦組織遷移組遷移的細(xì)胞數(shù)為(1．13±0．37)×103，與正常對照組(2．38±0．62)×103比較有顯著差異(P ＜0．05)。

3 討論

已有大量動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植對于多種原因造成的中樞神經(jīng)損傷具有促進(jìn)損傷修復(fù)和改善神經(jīng)功能的作用。在多種渠道的移植(損傷局部移植、靜脈內(nèi)注射移植和腦室內(nèi)移植等)研究［8-12］，均發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞有向損傷病灶聚集的趨勢，認(rèn)為與損傷局部微環(huán)境促進(jìn)移植細(xì)胞趨向遷移并有利于細(xì)胞在局部存活有關(guān)，但確切機(jī)制仍不明確。闡明其機(jī)制有助于采取積極手段促進(jìn)移植BMSCs向損傷病灶的聚集，提高移植治療效果。趨化因子是一類由70～100個(gè)氨基酸組成小分子分泌蛋白，其基本功能就是對表達(dá)有相應(yīng)趨化因子受體的細(xì)胞的定向趨化作用［21］。腦組織損傷后，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞在受到生長因子、干擾素等刺激誘導(dǎo)時(shí)可分泌出大量不同的趨化因子，BMSCs存在特定的趨化因子受體表達(dá)譜也已被大量的研究證實(shí)［22-23］。因此，趨化因子及其受體在BMSCs定向遷移中發(fā)揮的作用受到廣泛關(guān)注。

fractalkine是趨化因子CX3C亞家族的唯一成員，和其特異性受體CX3CR1相互作用，通過提高細(xì)胞粘附和促進(jìn)CX3CR1陽性細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移在組織損傷中發(fā)揮作用［15-17］。fractalkine是為數(shù)不多的表達(dá)于腦組織中的趨化因子之一，主要表達(dá)于神經(jīng)元，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注損傷后，病變側(cè)腦皮質(zhì)的中fractalkine mRNA表達(dá)增高，在缺血半球，可見大量fractalkine陽性細(xì)胞聚集在病灶周圍。靜脈移植的hMSCs能定向遷移到缺血再灌注損傷的大鼠腦組織中。定向遷移的hMSCs主要分布在fractalkine高表達(dá)的區(qū)域，干擾BMSCs上CX3CR1的表達(dá)，其向損傷腦組織的遷移能力明顯下降。以上結(jié)果說明fractalkine/CX3CR1在移植hMSCs向缺血損傷腦組織的定向遷移中發(fā)揮了重要作用。盡管上述研究發(fā)現(xiàn)fractalkine/CX3CR1系統(tǒng)與BMSCs向腦缺血病灶的定向遷移有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步的離體研究加以證實(shí)。

已有大量研究結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的BMSCs存在特定的趨化因子受體表達(dá)譜［22-23］。本研究采用密度梯度離心貼壁篩選法分離純化BMSCs，運(yùn)用realtime PCR和免疫組化技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平觀察到fractalkine特異性受體CX3CR1在BMSCs的表達(dá)。本研究向Transwell小室內(nèi)的無血清培養(yǎng)基加入fractalkine后遷移到聚碳酸酯膜底面BMSCs數(shù)量明顯增加，并且遷移細(xì)胞的數(shù)量與fractalkine濃度呈濃度依賴效應(yīng)，這一結(jié)果表明fractalkine是一種可以趨化BMSCs定向遷移的細(xì)胞因子。利用Transwell體外趨化遷移模型也證實(shí)BMSCs具有向缺血再灌注損傷腦組織定向遷移的能力，再灌注3和7 d組腦組織萃取液誘導(dǎo)遷移的BMSCs顯著高于正常大鼠腦組織萃取液，結(jié)合我們前期研究所發(fā)現(xiàn)的再灌注損傷后3和7 d缺血區(qū)周圍腦組織fractalkine表達(dá)顯著增高，提示缺血前后fractalkine的表達(dá)變化可能與BMSCs遷移數(shù)目變化相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中我們以CX3CR1抗體孵育BMSCs，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示封閉CX3CR1后，缺血腦組織萃取液誘導(dǎo)的BMSCs定向遷移受到影響(為正常對照組的47.5%)，這表明fractalkine/CX3CR1配體－受體作用促進(jìn)BMSCs向缺血腦組織的定向遷移，但由于CX3CR1抗體不能完全阻斷缺血腦組織萃取液誘導(dǎo)的BMSCs定向遷移，所以可以推測還應(yīng)有其他因子參與誘導(dǎo)BMSCs向腦缺血損傷區(qū)的定向遷移。

采用BMSCs進(jìn)行移植治療，其資源豐富，可來源于自體，無組織異源性，無倫理限制，能穿過血腦屏障并向大腦組織遷移與腦組織整合，易于臨床廣泛應(yīng)用，發(fā)展?jié)摿薮蟆１狙芯繛?fractalkine/CX3CR1參與了BMSCs向損傷處遷移提供了充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這為臨床應(yīng)用靜脈注射BMSCs治療神經(jīng)損傷性疾病提供了可能的治療方向。

［1］ Prockop D J．Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues［J］．Science，1997，276(5309):71-74．

［2］ Eckert M A，Vu Q，Xie K，et al．Evidence for high translational potential of mesenchymal stromal cell therapy to improve recovery from ischemic stroke［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2013，33(9):1322-1334．

［3］ Heo JS，Choi SM，Kim H O，et al．Neural transdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on hydrophobic polymer-modified surface and therapeutic effects in an animal model of ischemic stroke［J］．Neuroscience，2013，238:305-318．

［4］ Bilen S，Pinarli F，Ak F，et al．Treatment efficacy with bone marrow derived mesenchymal stem cells and minocycline in rats after cerebral ischemic injury［J］．Stem Cell Rev，2013，9(2):219-225．

［5］ 李明輝，田丁，劉聰燕，等．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及研究［J］．首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(2):183-186．

［6］ 朱淑霞，宋治遠(yuǎn)．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌組織工程［J］．武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18(4):366-370．

［7］ Ishizaka S，Horie N，Satoh K，et al．Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke［J］．Stroke，2013，44(3):720-726．

［8］ Lee R H，Hsu SC，Munoz J，et al．A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially engraft in mice［J］．Blood，2006，107(5):2153-2161．

［9］ Chen J，Li Y，Wang L，et al．Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］．Stroke，2001，32(4):1005-1011．

［10］ Li Y，Chen J，Wang L，et al．Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells［J］．Neurology，2001，56(12):1666-1672．

［11］ Hess D C，Hill W D，Martin-Studdard A，et al．Bone marrow as a source of endothelial cells and NeuN-expressing cells After stroke［J］．Stroke，2002，33(5):1362-1368．

［12］ Shichinohe H，Kuroda S，Yano S，et al．Improved expression of gamma-aminobutyric acid receptor in mice with cerebral infarct and transplanted bone marrow stromal cells:an autoradiographic and histologic analysis［J］．J Nucl Med，2006，47(3):486-491．

［13］ Harrison JK，Jiang Y，Chen S，et al．Role for neuronally derived fractalkine in mediating interactions between neurons and CX3CR1-expressing microglia［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，1998，95(18):10896-10901．

［14］ Cardona A E，Pioro E P，Sasse M E，et al．Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor［J］．Nat Neurosci，2006，9(7):917-924．

［15］ Bazan J F，Bacon K B，Hardiman G，et al．A new class of membrane-bound chemokine with a CX3C motif［J］．Nature，1997，385(6617):640-644．

［16］Haskell CA，Cleary M D，Charo I F．Unique role of the chemokine domain of fractalkine in cell capture．Kinetics of receptor dissociation correlate with cell adhesion［J］．J Biol Chem，2000，275(44):34183-34189．

［17］Verge G M，Milligan E D，Maier SF，et al．Fractalkine(CX3CL1)and fractalkine receptor(CX3CR1)distribution in spinal cord and dorsal root ganglia under basal and neuropathic pain conditions［J］．Eur JNeurosci，2004，20(5):1150-1160．

［18］ Zhu J，Zhou Z，Liu Y，et al．Fractalkine and CX3CR1 are involved in the migration of intravenously grafted human bone marrow stromal cells toward ischemic brain lesion in rats［J］．Brain Res，2009，1287:173-183．

［19］ Nagasawa H，Kogure K．Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］．Stroke，1989，20(8):1037-1043．

［20］ Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84-91．

［21］Murdoch C，F(xiàn)inn A．Chemokine receptors and their role in vascular biology［J］．J Vasc Res，2000，37(1):1-7．

［22］ Ji J F，He B P，Dheen ST，et al．Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury［J］．Stem Cells，2004，22(3):415-427．

［23］ Sordi V，Malosio M L，Marchesi F，et al．Bone marrow mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chemokine receptors capable of promoting migration to pancreatic islets［J］．Blood，2005，106(2):419-427．