吳晶晶 王愛(ài)印 周 敏 陳 林 謝 潔

（西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715）

蠶桑產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物蠶沙及桑枝富含纖維素，但均未被有效利用［1－3］。我國(guó)僅五大蠶區(qū)的蠶沙年產(chǎn)量已超過(guò)100萬(wàn)t［4］；2013年我國(guó)桑園面積超過(guò)84．7萬(wàn)hm2［5］，桑樹用葉后產(chǎn)生大量廢棄桑枝。目前，大部分蠶沙被直接廢棄或不經(jīng)處理作為農(nóng)田肥料［1］，而桑枝常被廢棄田間或焚燒［3，6］。蠶沙及桑枝現(xiàn)有處理方式，不僅帶來(lái)極大的環(huán)境污染，也使蘊(yùn)藏在其中以纖維素為主的生物質(zhì)能源未被有效利用。多種真菌、細(xì)菌能通過(guò)產(chǎn)生纖維素酶而在自然界纖維素的降解過(guò)程發(fā)揮作用［7－8］。富含纖維素生物質(zhì)原料的酶解條件溫和，且不帶來(lái)次生環(huán)境污染，篩選獲得纖維素酶高產(chǎn)菌株對(duì)蠶桑產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物的有效利用具有重要作用。

校園富含枯枝落葉的土壤有利于纖維素酶產(chǎn)生菌的富集。在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，土壤中存在的微生物可以通過(guò)分泌包括纖維素酶在內(nèi)的多種酶類參與環(huán)境物質(zhì)循環(huán)。本研究選擇從校園綠化林地土壤中分離纖維素酶產(chǎn)生菌，通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基水解圈法及胞外纖維素酶測(cè)定方法篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株，并對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行了菌種鑒定。以期為包括蠶沙、桑枝在內(nèi)的富含纖維素生物質(zhì)原料的降解及潔凈能源的開發(fā)提供潛在生產(chǎn)菌。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 土壤樣品

采自西南大學(xué)校園綠化地。

1．1．2 培養(yǎng)基配方

初篩培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基）：CMC－Na 15g，NH4NO31g，蛋白胨1g，MgSO4·7H2O 0．5g，KH2PO41g，瓊脂20g，H2O 1 000mL，pH7．0，121℃滅菌20min后備用［9］。鑒別培養(yǎng)基（剛果紅培養(yǎng)基）：KH2PO40．5g，MgSO40．25g，瓊脂18．0g，明膠2．0g，CMC－Na 2．0g，剛果紅0．20g，蒸餾水1 000mL，pH7．0［9］。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母粉10g，CMC－Na 10g，NaCl 1．5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0．3g，pH7．0［10］，蒸餾水1 000mL。

1．2 方法

1．2．1 纖維素酶產(chǎn)生菌的分離

稱取1g土壤樣品加入到99mL含有玻璃珠的生理鹽水中，作為10－2稀釋度，振蕩30min混勻后做一系列10倍稀釋，將10－3、10－4、10－5稀釋液各取100μL涂布于初篩羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度2次重復(fù)。28℃培養(yǎng)48h挑取生長(zhǎng)較快的單菌落在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上純化獲得純培養(yǎng)［11］。

1．2．2 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選與保存

初篩獲得的菌株用滅菌接種環(huán)點(diǎn)接至剛果紅培養(yǎng)基表面，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)48h，根據(jù)菌體在剛果紅培養(yǎng)基平板上形成水解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值的大小，初步判斷菌株纖維素酶活性，之后選取直徑比（D／d）較大且生長(zhǎng)迅速的菌株進(jìn)行下一步研究［12］。同時(shí)，從平板上挑取單菌落接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，160r／min震蕩培養(yǎng)24h后，取500uL菌液加入等體積30%甘油，于1．5mL離心管中混勻后保存至－80℃冰箱備用。

1．2．3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取100℃干燥至恒重的葡萄糖0．10g，加蒸餾水溶解并定容至1．00ml，配成1．00mg／ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支帶有刻度的試管，首先按表1加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用蒸餾水定容至總體積2mL后加入DNS試劑3mL，沸水浴反應(yīng)10min，取出冷卻后補(bǔ)加蒸餾水至總體積25ml，充分混勻，用空白管溶液調(diào)零，在540nm測(cè)定各管的吸光值。用EXCEL軟件，以葡萄糖質(zhì)量數(shù)（mg）為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)加入各試管中的葡萄糖量

1．2．4 纖維素酶活性的測(cè)定

參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，用DNS法測(cè)定產(chǎn)酶菌株發(fā)酵上清液水解CMC－Na后生成的葡萄糖量。酶促反應(yīng)體系包括用0．2MpH4．8的乙酸緩沖液配置的1%CMC－Na溶液1mL，目的菌株發(fā)酵上清液1mL（對(duì)照管加入滅活的發(fā)酵上清液），充分混勻后置于50℃酶促反應(yīng)30min，隨后迅速加入DNS試劑3mL，沸水浴10min后加入去離子水定容至25mL。用對(duì)照管調(diào)零，在540nm測(cè)定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，以三次平行測(cè)定平均值計(jì)算還原糖生成量［13］。以每毫升發(fā)酵上清液酶促反應(yīng)30min釋放1ug葡萄糖的量為一個(gè)酶活單位（U）。本研究測(cè)定了目的菌株發(fā)酵12h，24h，48h，72h及96h菌株SWU6發(fā)酵上清液的纖維素酶活性。

1．2．5 菌種鑒定

1．2．5．1 菌體培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察

在28℃，馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)目的菌株24～48h觀察菌落形態(tài)特征，將目的菌株接種到剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后觀察菌落水解圈。將在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48h的目的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色。

1．2．5．2 生理生化反應(yīng)特征測(cè)定

菌株需氧性、運(yùn)動(dòng)性測(cè)定、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原等試驗(yàn)均參照文獻(xiàn)進(jìn)行［14，15］。

1．2．5．3 基于16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將目的菌株接種至PDA固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)36h后，提取基因組DNA作為模板，用細(xì)菌16SrDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′和1492R：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，純化PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序。所得16SrDNA序列在 GenBank里進(jìn)行比對(duì)（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST），下載同源性較高序列，利用MEGA4．0軟件，使用N－J法進(jìn)行1 000次步長(zhǎng)計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

2 結(jié)果與分析

2．1 纖維素酶產(chǎn)生菌的分離與篩選

從校園綠化地土壤中初篩獲得10個(gè)能夠產(chǎn)生纖維素酶的分離株，將其接種于鑒別培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h后測(cè)量水解圈直徑與菌落直徑的比值，其中SWU6菌株水解圈與菌落直徑比值最大，為9．12（表2）。

表2 纖維素酶產(chǎn)生菌水解圈直徑與菌落直徑比值

圖1 SWU6菌株發(fā)酵不同時(shí)間發(fā)酵上清液纖維素酶活力

2．2 纖維素酶活性的測(cè)定

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回歸方程為：y＝0．646 8x＋0．044 4，R2＝0．986 8，并據(jù)此測(cè)定目的菌株SWU6發(fā)酵12h，24h，48h，72h及96h上清液的纖維素酶活性分 別 為 110．37U／mL，136．24U／mL，131．93U／mL，126．55U／mL，126．98U／mL（圖1）。SWU6菌株發(fā)酵前期纖維素酶活性逐漸升高，24h左右達(dá)到峰值，隨后單位體積發(fā)酵上清液的纖維素酶活性呈下降趨勢(shì)。

2．3 菌種鑒定

2．3．1 菌落及菌體形態(tài)特征

圖2 SWU6菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征

SWU6菌株在PDA培養(yǎng)基表面形成的菌落呈乳白色、透明、濕潤(rùn)、圓形，表面光滑，中央凸起，有光澤（圖2）。其在半固體培養(yǎng)基表層擴(kuò)散生長(zhǎng)，為具運(yùn)動(dòng)性的好氧菌（表3）。革蘭氏染色結(jié)果表明SWU6菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌（圖3，表3）。SWU6菌株經(jīng)芽孢染色后觀察，其菌體中央具有單個(gè)橢圓形綠色芽孢（圖4，表3）。

表3 菌株SWU6的形態(tài)及培養(yǎng)特征

圖3 SWU6菌株革蘭氏染色結(jié)果

圖4 SWU6菌株芽孢染色結(jié)果

2．3．2 SWU6菌株的生理生化特征

生理生化檢測(cè)結(jié)果表明，纖維素酶產(chǎn)生菌SWU6菌株過(guò)氧化氫酶、硝酸鹽還原呈陽(yáng)性；能夠水解淀粉、液化明膠；能夠在含7%NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（表4）。結(jié)合對(duì)菌株SWU6的形態(tài)及培養(yǎng)特征菌株觀察結(jié)果，初步判斷纖維素酶產(chǎn)生菌SWU6為芽孢桿菌屬菌株。

表4 菌株SWU6的生理生化特征

2．3．3 基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

以SWU 6菌株基因組DNA為模板，用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)約1500bp的片段?；厥漳康钠嗡椭辽虾Ｉ锕こ坦煞萦邢薰緶y(cè)序，得到一條長(zhǎng)為1457bp的片段。該序列在NCBI上的Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示，其與多株芽孢桿菌屬菌株的16SrDNA序列的相似度在98%以上，基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明SWU6菌株與登錄號(hào)為NR 116240甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）處于同一最小分支 （圖5）。根據(jù)SWU6菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化特征測(cè)定結(jié)果，并結(jié)合基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析，將該纖維素酶產(chǎn)生菌鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）。

圖5 SWU6菌株基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

利用纖維素酶高產(chǎn)菌株對(duì)蠶沙、桑枝等富含纖維素的生物質(zhì)原料進(jìn)行處理能為開發(fā)潔凈能源提供新的選擇。本文利用鑒別培養(yǎng)基水解圈法篩選獲得纖維素酶產(chǎn)生菌SWU6菌株，并采用胞外酶活檢測(cè)方法（DNS法）測(cè)定了發(fā)酵不同時(shí)間上清液的纖維素酶活性。檢測(cè)結(jié)果表明SWU6菌株發(fā)酵24h，其纖維素酶活達(dá)到峰值。根據(jù)該菌株的形態(tài)特征、生理生化檢測(cè)結(jié)果以及基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）。芽孢桿菌是自然界中降解纖維素的主要細(xì)菌，其中枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌常表現(xiàn)出最高的纖維素酶生產(chǎn)活性［17］，而甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生纖維素酶卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

蠶沙、桑枝等蠶桑產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物的加工處理通常需要纖維素酶、木質(zhì)素降解酶類及半纖維素酶等多種酶協(xié)同完成。后續(xù)研究將在本文研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化B．methylotrophicusSWU 6菌株產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件。同時(shí)，進(jìn)一步分離篩選多種酶類的高產(chǎn)菌株，構(gòu)建復(fù)合菌劑，用其處理蠶沙、桑枝等廢棄生物質(zhì)原料，以期在生產(chǎn)中提高蠶桑產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物加工處理的效率及質(zhì)量。

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