栢鳳女，劉建學(xué)，韓四海，徐寶成，李佩艷，羅登林，田 碩

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因[1]，全球每年發(fā)生高達(dá)1.5億的腹瀉病例中，有70%是由各種致病性微生物污染食品所引起[2]，因而快速、簡(jiǎn)便、特異的檢測(cè)方法成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)代生物技術(shù)檢測(cè)方法如基因芯片技術(shù)[3-5]、多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[6-7]、免疫磁珠分離技術(shù)[8]等分析方法用于微生物的鑒定已得到廣泛認(rèn)可，但這些方法操作復(fù)雜，試劑昂貴，需要專業(yè)的操作人員。因此，更簡(jiǎn)易的食源性致病菌的近紅外快速鑒別方法需要研究。

近紅外光譜分析技術(shù)以其快速、無(wú)損、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[9]，廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)[10]、石油化工[11]、藥物分析[12-13]、食品分析[14]、紡織品[15]等領(lǐng)域。支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）是Vapnik在1995年提出的一種研究有限樣本情形下統(tǒng)計(jì)規(guī)律機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)[16]，是一種針對(duì)小樣本情況研究統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)規(guī)律的理論，該理論的核心思想是通過(guò)采用結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化準(zhǔn)則來(lái)控制學(xué)習(xí)機(jī)器的容量，從而刻畫了過(guò)度擬合與泛化能力之間的關(guān)系。較之于傳統(tǒng)方法，支持向量機(jī)克服了傳統(tǒng)方法的大樣本要求與維數(shù)災(zāi)難及局部極小問(wèn)題，能夠較好地解決神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)難以解決的小樣本、高維數(shù)和存在局部極小點(diǎn)等實(shí)際問(wèn)題，并在處理非線性、小樣本、高維數(shù)、局部極小值等模式識(shí)別問(wèn)題時(shí)顯示了其卓越的優(yōu)越性[17-19]。其出色的學(xué)習(xí)能力使得該技術(shù)已成為機(jī)器學(xué)習(xí)界的研究熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)將近紅外光譜數(shù)據(jù)通過(guò)主成分分析法進(jìn)行壓縮后，采用支持向量機(jī)對(duì)3 種食源性致病菌進(jìn)行分類鑒別研究。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

腸出血性大腸桿菌O157∶H7（E.coliO157:H7）河南省出入境檢驗(yàn)檢疫局；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）河南省洛陽(yáng)市疾病預(yù)防與控制中心。

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯 北京奧博星公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯，參考YY/T 1187—2010《營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基》；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，參考YY/T 0577—2005《營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)》。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HS-840U型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；全溫空氣搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)、真空冷凍干燥機(jī) 北京比朗實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VECTOR-33型傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司；分析軟件為OPUS 6.5與SPSS，算法處理軟件為Matlab 7.0。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌樣品的制備

將分別在37 ℃條件下的單菌落大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別以9 000 r/min（大腸桿菌O157∶H7）離心10 min，4 000 r/min（單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌）離心20 min，無(wú)菌水洗滌3 次后收集濕菌體，將濕菌體經(jīng)真空冷凍干燥至恒質(zhì)量，制得干菌體。

1.3.2 樣本采集

3 種食源性致病菌均以一個(gè)單菌落為一個(gè)樣本，共采集樣本90 個(gè)，其中72 個(gè)（大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌樣本分別為24 個(gè)）作為訓(xùn)練集樣本，余下的18 個(gè)（大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌樣本分別為6 個(gè)）作為預(yù)測(cè)集樣本。

1.3.3 檢測(cè)樣品的制備

采用溴化鉀壓片法制備檢測(cè)樣品。取樣品1～2 mg于瑪瑙研缽中與100 mg預(yù)先干燥的溴化鉀混合在紅外燈下研磨至2 μm左右的顆粒，使樣品與溴化鉀混合均勻，將混合物于20 MPa條件下壓制成均勻的透明薄片。

1.3.4 近紅外光譜采集

在溫度為20～22 ℃，濕度為30%～40%的條件下，采用傅里葉變換紅外光譜儀采集樣品透射光譜，儀器預(yù)熱30 min后，以未加樣品的溴化鉀薄片為背景，采集含樣品的溴化鉀薄片的近紅外透射光譜。設(shè)置參數(shù)為分辨率4 cm－1，掃描次數(shù)64 次，波數(shù)范圍10 000～4 000 cm－1。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3 次，取其平均光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理

為去除隨機(jī)噪聲、基線漂移等與待測(cè)樣品性質(zhì)無(wú)關(guān)的因素的影響，需要對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。在OPUS 6.5分析軟件中對(duì)所采集的近紅外光譜進(jìn)行基線校正、平滑（平滑點(diǎn)數(shù)為9）、一階導(dǎo)數(shù)和矢量歸一化處理。平滑可去除高頻噪音對(duì)所測(cè)樣品信號(hào)的干擾，提高分析信號(hào)的信噪比；一階導(dǎo)數(shù)可消除基線漂移，強(qiáng)化譜帶特征；矢量歸一化處理可消除因樣品厚度不同帶來(lái)的測(cè)量誤差，并保持光譜的特征。

圖1 食源性致病菌近紅外透射光譜Fig.1 NIR transmittance spectra of three species of food-borne bacteria

由圖1可見(jiàn)，3 種食源性致病菌在7 500～4 000 cm－1有吸收，在6 200～4 000 cm－1所含信息量更為豐富，選擇對(duì)含信息量豐富的這一波數(shù)范圍的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行研究分析。從圖譜來(lái)看，不同食源性致病菌的近紅外透射譜圖比較相似，肉眼無(wú)法對(duì)其進(jìn)行分辨。

2.2 主成分分析法壓縮數(shù)據(jù)

由于近紅外光譜反映的是化學(xué)組分對(duì)近紅外光吸收的倍頻和組合頻信息，光譜信息有嚴(yán)重重疊，食源性致病菌近紅外光譜中所包含數(shù)據(jù)量龐大，利用原始光譜數(shù)據(jù)建立模型會(huì)導(dǎo)致建模時(shí)間長(zhǎng)，且無(wú)法消除光譜中相互重疊的信息。因此，在建立預(yù)測(cè)模型前，需要對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行壓縮處理，本實(shí)驗(yàn)選擇主成分分析法對(duì)食源性致病菌近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行壓縮，將原變量進(jìn)行轉(zhuǎn)換，使少數(shù)個(gè)新變量代替原變量，并盡可能多地表征原變量的數(shù)據(jù)特征而不丟失信息。經(jīng)轉(zhuǎn)換得到的新變量是互不相關(guān)的，消除了眾多信息共存中相互重疊的信息部分。對(duì)全部食源性致病菌近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到前26 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率，如表1所示，前26 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)99.99%，反映了原光譜矩陣的全部光譜信息。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇將每個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)用前26 個(gè)主成分代替，作為支持向量機(jī)分類器的輸入向量，進(jìn)行支持向量機(jī)算法的食源性致病菌的識(shí)別研究。

表1 主成分累積貢獻(xiàn)率Table 1 Cumulative contribution rates of principal components

2.3 基于支持向量機(jī)的食源性致病菌識(shí)別模型的建立

將72 個(gè)樣本的主成分得分作為支持向量機(jī)算法的訓(xùn)練集，余下的18 個(gè)樣本的主成分得分作為支持向量機(jī)算法的預(yù)測(cè)集，采用支持向量機(jī)方法對(duì)食源性致病菌進(jìn)行分類。

2.3.1 支持向量機(jī)算法及核函數(shù)

設(shè)訓(xùn)練集樣本為：

引入核函數(shù)K（xi，x），問(wèn)題變?yōu)橥ㄟ^(guò)非線性變換轉(zhuǎn)化到高維空間中求解最優(yōu)分類面的問(wèn)題，通過(guò)選擇核函數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)十分復(fù)雜的非線性分類。首先對(duì)ai求解下列函數(shù)的最大值。

并式（3）為分類函數(shù)

即為非線性支持向量機(jī)。其基本思想可概括為：通過(guò)非線性變換將輸入空間變換到一個(gè)高維空間，在這個(gè)新空間中求最優(yōu)線性分類面。

核函數(shù)形式一般有3類：

1）p階多項(xiàng)式形：

2）徑向基函數(shù)（radial basis function，RBF）形：

3）Sigmoid函數(shù)形：

本研究選用核函數(shù)為式（4）和（5）的支持向量機(jī)算法進(jìn)行模型識(shí)別能力的比較。

2.3.2 核參數(shù)的選擇

在核函數(shù)的核參數(shù)中，p的大小嚴(yán)重影響分類器分類的準(zhǔn)確性[20-23]，因此，為了獲得一個(gè)很好的SVM分類器，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)選取最優(yōu)的p值。

在Matlab 7.0環(huán)境下進(jìn)行SVM算法的編程，實(shí)現(xiàn)兩種核函數(shù)下的SVM分類器，以訓(xùn)練集72 個(gè)樣本的26 個(gè)主成分向量為輸入數(shù)據(jù)建立模型。本實(shí)驗(yàn)中所選取的多項(xiàng)式核函數(shù)參數(shù)為1、2、3、4；所選取的RBF核函數(shù)參數(shù)為0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5。表2和表3分別表示了多項(xiàng)式分類器和RBF分類器在不同的核參數(shù)p值下對(duì)食源性致病菌的訓(xùn)練正確率。

表2 多項(xiàng)式核函數(shù)支持向量機(jī)訓(xùn)練集分類結(jié)果Table 2 Identi fication results with polynomial SVM classi fiers for training set %

表3 RBF核函數(shù)支持向量機(jī)訓(xùn)練集分類結(jié)果Table 3 Identi fication results with RBF SVM classi fiers for training set %

由表2可知，當(dāng)多項(xiàng)式核函數(shù)參數(shù)為2時(shí)可得最佳分類結(jié)果，3 種菌的訓(xùn)練正確率分別為95.83%、100%、95.83%。當(dāng)核參數(shù)大于2時(shí)，其分類結(jié)果變化不大，核參數(shù)為1的多項(xiàng)式核函數(shù)支持向量機(jī)是線性的，其分類效果最差，3 種菌的訓(xùn)練正確率僅僅為83.33%、87.5%、75%。表3結(jié)果顯示，當(dāng)RBF核函數(shù)參數(shù)為0.5時(shí)，可得最佳訓(xùn)練結(jié)果。對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌的訓(xùn)練正確率分別為100%、100%、100%。

由表2和表3可確定兩種核函數(shù)支持向量機(jī)最佳核參數(shù)，多項(xiàng)式核函數(shù)參數(shù)為2，RBF核函數(shù)參數(shù)為0.5。以確定的兩種核函數(shù)支持向量機(jī)在最佳核參數(shù)對(duì)食源性致病菌近紅外光譜進(jìn)行預(yù)測(cè)，其結(jié)果如表4所示。由表4可知，選擇RBF核函數(shù)的支持向量機(jī)對(duì)食源性致病菌近紅外光譜的分類效果優(yōu)于多項(xiàng)式核函數(shù)的支持向量機(jī)。RBF核函數(shù)的支持向量機(jī)對(duì)大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌的預(yù)測(cè)正確率均為100%。

表4 兩種核函數(shù)支持向量機(jī)對(duì)食源性致病菌的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Identi fication results for food-borne bacteria with the two classi fiers

為考察主成分方法對(duì)原始數(shù)據(jù)的壓縮性能，利用表1中前13 個(gè)主成分作為支持向量機(jī)分類器的輸入向量，采用前述所選用核函數(shù)參數(shù)（即多項(xiàng)式參數(shù)為2，RBF參數(shù)為0.5），重新進(jìn)行支持向量機(jī)算法的食源性致病菌識(shí)別研究，其結(jié)果與以26 個(gè)主成分為支持向量機(jī)分類器的輸入量進(jìn)行計(jì)算的結(jié)果一致。說(shuō)明前13 個(gè)主成分即可表征原數(shù)據(jù)特征而不丟失信息，因此可以選擇前13 個(gè)主成分作為輸入量，進(jìn)一步達(dá)到壓縮數(shù)據(jù)的目的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以近紅外光譜法結(jié)合支持向量機(jī)對(duì)3 種食源性致病菌進(jìn)行了分類鑒別，以RBF函數(shù)與多項(xiàng)式函數(shù)為核函數(shù)，確定了RBF核函數(shù)與多項(xiàng)式核函數(shù)的最佳核參數(shù)分別為0.5和2。對(duì)最佳核參數(shù)下的兩種核函數(shù)支持向量機(jī)的分類性能進(jìn)行比較，以RBF為核函數(shù)的支持向量機(jī)對(duì)3 種食源性致病菌判別能力優(yōu)于多項(xiàng)式核函數(shù)，其預(yù)測(cè)正確率均達(dá)100%。分別以前26 個(gè)主成分和前13 個(gè)主成分作為支持向量機(jī)分類器輸入向量，結(jié)果顯示，以前13 個(gè)主成分作為支持向量機(jī)分類的輸入向量的結(jié)果與以前26 個(gè)主成分作為輸入向量的計(jì)算結(jié)果一致，說(shuō)明前13 個(gè)主成分即可表征原變量的數(shù)據(jù)特征，且不丟失信息。

基于支持向量機(jī)的食源性致病菌近紅外光譜鑒別技術(shù)，融合了近紅外光譜技術(shù)的快速、環(huán)保、穿透性強(qiáng)與支持向量機(jī)的高泛化能力，以及克服傳統(tǒng)方法的大樣本要求等特點(diǎn)。與現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)相比，該技術(shù)具有安全高效、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)在線、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。盡管本研究取得了較好的結(jié)果，但由于近紅外光譜技術(shù)本身的局限性與實(shí)際生產(chǎn)中的復(fù)雜多樣性，要將該技術(shù)在未來(lái)的檢測(cè)工作中進(jìn)行推廣與應(yīng)用，今后的研究工作應(yīng)致力于新的處理方法及對(duì)近紅外光譜有特異吸收的致病菌組分的研究，為開(kāi)發(fā)研制便攜式食源性致病菌快速檢測(cè)儀和生產(chǎn)用食源性致病菌快速在線檢測(cè)分析系統(tǒng)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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