張朋杰，張憲臣,，王 勇，楊 芳，李雙宜，李 蓉，華洪波，胡儀光，盧俊文

（1.中山出入境檢驗檢疫局，廣東 中山 528403；2.中山市廣東外語外貿(mào)大學(xué)附設(shè)外語學(xué)校，廣東 中山 528401）

葡萄酒是世界性的酒精飲料，其歷史可以追溯到7 000多年前。由于其含有水、糖、酒精、甘油、有機酸、酯類、多種礦物質(zhì)等多達1 000多種的有益物質(zhì)而越來越被人們喜愛。西拉葡萄酒產(chǎn)量在總的葡萄酒產(chǎn)量中所占的比例較大，目前進口西拉葡萄酒的主要原產(chǎn)地為澳大利亞，在澳大利亞有葡萄的地方就有西拉，大約一半以上的葡萄種植區(qū)的葡萄藤上掛的是西拉，所釀制的葡萄酒也享譽世界。近年來，受白酒漲價、年輕一代的飲食習(xí)慣改變等因素的影響，我國的葡萄酒的消費量急劇增加，從而也促進葡萄酒進口量顯著增加，進口葡萄酒在中國市場上迅速增長，隨著進口葡萄酒量的增長，也伴隨著一些問題出現(xiàn)，其中尤以不法商販以假亂真、以次充好，其中把價值幾歐元的葡萄酒賣給消費者幾百甚至上千人民幣的現(xiàn)象最為突出。

指紋圖譜是隨著現(xiàn)代分析技術(shù)發(fā)展而誕生的一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)，已經(jīng)在環(huán)境保護、食品評價、中藥質(zhì)量控制[1-4]等許多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。葡萄酒指紋圖譜是利用指紋圖譜技術(shù)，對葡萄酒整體信息進行描述，進而對葡萄酒的品種、產(chǎn)地、酒齡等進行鑒別并對葡萄酒的品質(zhì)進行評估。生成指紋圖譜的方法主要有紅外光譜法[5]、高效液相色譜法[6-17]、氣相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用法[18-22]、液-質(zhì)聯(lián)用法[23-26]等。葡萄酒營養(yǎng)豐富，其中以酚類化合物含量較大，是葡萄酒重要的組成成分，決定著葡萄酒的色澤、收斂性、苦味等特性，所以對葡萄酒中的酚類化合物的檢測分析具有重要意義，以此為出發(fā)點，本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（high perfomance liquid chromatography-diode array detector-ion trap mass spectromtry，HPLC-DAD-MS）技術(shù)測定進口西拉葡萄酒乙酸乙酯提取物中的多種單體酚，以質(zhì)譜定性共有峰，建立進口西拉葡萄酒的特征指紋圖譜。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

澳大利亞西拉紅葡萄酒10 批，灌裝日期分別為20100322（S1）、20100427（S2）、20100511（S3）、20110603（S4）、20100810（S5）、20101114（S6）、20101210（S7）、20110208（S8）、20110317（S9）、20110424（S10）。

沒食子酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶酸、對香豆酸、水楊酸、香豆素、槲皮苷、楊梅酮、 反式-白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于98%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（均為色譜純） 德國Merck公司；實驗用水為一級水。

1200 HPLC儀（含DAD檢測器） 美國Agilent公司； LCQ離子阱質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國密理博公司；Heidolph-4003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；Sartorius-Sigma 3-16pk低溫離心機 德國Sigma公司；HF-2000電子天平 日本AND公司；MMV-1000W垂直振蕩器 日本東京理化公司；超聲波清洗器 美國Crest公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

按純度折算分別稱取沒食子酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶酸、對香豆酸、水楊酸、香豆素、槲皮苷、楊梅酮、反式-白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在－20 ℃保存。使用前，根據(jù)實驗需要將該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用甲醇稀釋至適宜質(zhì)量濃度，以配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品制備

稱取30 g（精確至0.01 g）葡萄酒樣品至50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，用垂直振蕩器振蕩提取10 min，低溫離心機4 500 r/min條件下離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，下層溶液用乙酸乙酯再重復(fù)提取2 次（每次20 mL），合并所有提取液，在40 ℃條件下減壓濃縮至近干，用3 mL甲醇超聲溶解殘渣，渦旋，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：MG Ⅱ C18柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.25 mL/min；檢測波長：0～34 min、280 nm，34～38.5 min、254 nm，38.5～60 min、280 nm；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.4 質(zhì)譜條件

噴霧電壓5.0 kV；金屬毛細管溫度300℃；鞘氣壓力28 arb；輔助氣壓力19 arb；采用負(fù)離子模式，掃描范圍m/z50～1 200；源內(nèi)分裂電壓 15 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

本實驗用DAD檢測器分別對11 種標(biāo)準(zhǔn)品溶液在190～400 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示，11 種標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰各不相同，除槲皮苷、楊梅酮外，其余標(biāo)準(zhǔn)品在280 nm波長處均有較大吸收峰；槲皮苷、楊梅酮在280 nm波長處為負(fù)峰，而在254 nm有較大吸收峰，因此，本實驗的檢測波長設(shè)定為：0～34 min、280 nm，34～38.5 min、254 nm，38.5～60 min、280 nm。

2.2 流動相條件的選擇

本實驗選用兩種流動相組成，設(shè)定了4 個不同的梯度洗脫程序：

流動相Ⅰ：流動相A：甲醇，流動相B：水（pH 3.0）。洗脫程序?。?～10 min，A為3%～20%；10～35 min，A為20%～35%；35～45 min，A為35%～45%；45～60 min，A為45%；60～65 min，A為45%～3%。洗脫程序ⅱ：0～15 min，A為5%～15%；15～40 min，A為15%～35%；40～50 min，A為35%～40%；50～65 min，A為40%；65～70 min，A為40%～5%。

流動相Ⅱ：流動相A：乙腈，流動相B：水（pH 3.0）。洗脫程序?。?～12 min，A為3%～12%；12～45 min，A為12%～42%；45～60 min，A為42%；60～70 min，A為42%～3%。洗脫程序ⅱ：0～30 min，A為3%～18%；30～55 min，A為18%～38%；55～65 min，A為38%；65～70 min，A為38%～3%。洗脫程序ⅲ：0～30 min，A為3%～20%；30～45 min，A為20%～30%；45～55 min，A為30%；55～60 min，A為30%～3%。

結(jié)果表明，采用乙腈作為流動相時各單體的分離效果要明顯好于甲醇做流動相時的分離效果，綜合考慮分離效果和分析時間，最終選用乙腈作為實驗用流動相，洗脫程序為ⅲ：0～30 min，A為3%～20%；30～45 min，A為20%～30%；45～55 min，A為30%；55～60 min，A為30%～3%，混合標(biāo)樣的色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)樣的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standards

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

表2 11種化合物的保留時間，回歸方程和檢測限Table 2 Retention times, linear equations and limits of detections of 11 compounds

配制質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200、400 μg/mL的11 種標(biāo)準(zhǔn)混合樣，按照測定條件進樣，以峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計算得到11 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，它們的保留時間、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和最低檢測限（RSN=3）見表2。

2.4 儀器穩(wěn)定性檢測

在1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)測定條件下，將25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣6 次，對11 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間和峰面積進行統(tǒng)計分析，色譜穩(wěn)定性見表3。結(jié)果表明，11 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于1.0%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均低于3%。這說明在本方法的色譜條件下，工作穩(wěn)定，數(shù)據(jù)的重復(fù)性較好，符合定性定量的基本要求。

表3 色譜穩(wěn)定性實驗（n=6）Table 3 Stability of chromatographic analysis (n=6)

2.5 各單體酚回收率和精密度實驗

向已知11 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度的紅酒樣品中定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照樣品處理方法制備紅酒樣品，重復(fù)6 次，各吸取10 μL進樣，分別計算各組分的回收率和精密度，見表4。

表4 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果（n=6）Table 4 Results of precision and recovery tests for 11 compounds (n=6)

2.6 指紋圖譜的建立

取10批次澳大利亞產(chǎn)的維拉西拉葡萄酒按樣品處理方法得供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL進樣檢測記錄60 min DAD色譜圖。結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（版本2004 A）》軟件，進行指紋圖譜分析，采用平均數(shù)法進行計算，生成對照指紋圖譜R，見圖2。

圖2 維拉西拉葡萄酒的對照指紋圖譜Fig.2 Standard fingerprint pro file of Vigara Shiraz wine

圖3 15 個共有峰離子掃描圖Fig.3 Ion scan chromatograms of 15 common peaks

對10批次的色譜圖和11 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖進行對比，發(fā)現(xiàn)樣品指紋圖譜中與對香豆酸（9號峰）保留時間一致的色譜峰的峰面積百分比較大，并且其保留時間居中有利于辨認(rèn)評價指紋圖譜的特征，因此選擇對香豆酸為參照峰（S峰），其余篩選出強度較大的共有峰15 個，離子掃描圖見圖3。

通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和質(zhì)譜離子掃描圖比較，確定1號峰為沒食子酸，5號峰為香草酸，6號峰為丁香酸，8號峰為表兒茶酸，9號為對香豆酸，14號峰為楊梅酮，其余為未知峰。

2.7 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.7.1 精密度實驗

取葡萄酒（S1）供試液，連續(xù)進樣6 次，以對香豆酸色譜峰為參照峰（S峰），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.3%，相對峰面積的RSD值均小于8.2%，表明儀器的精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性實驗

取同一批次維拉西拉葡萄酒（S1），稱取6 份樣品，制備6 份供試品溶液，按測定條件平行測定，以對香豆酸色譜峰為參照峰（S峰），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.3%，相對峰面積的RSD值均小于4.2%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性實驗

取葡萄酒（S1）供試液，分別在0、8、16、24、36、48 h不同時間點進行測定，以對香豆酸色譜峰為參照峰（S峰），計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.3%，相對峰面積的RSD值均小于10%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.8 實際樣品的相似度分析

將10 批澳大利亞維拉西拉葡萄酒，按照樣品制備方法得供試液進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（版本2004 A）》軟件，以對照指紋圖譜R（圖2）為參照圖譜，自動匹配計算樣品的相似度，結(jié)果見表5，10 批維拉西拉葡萄酒的疊加色譜圖見圖4。

表5 10 批次維拉西拉葡萄酒相似度評價Table 5 Similarity of 10 batches of Vgara Shiraz wine

圖4 10 批維拉西拉葡萄酒的疊加色譜圖Fig.4 Chromatographic overlaps of 10 batches of Vigara Shiraz wine

由表5可知，除樣品S5外，其余樣品與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.99，樣品S5與對照指紋圖譜R的相似度在0.98～0.99之間。綜上，樣品與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.90，符合指紋圖譜的要求，比較全面地反映了維拉西拉葡萄酒指紋圖譜的相似關(guān)系。

3 結(jié) 論

本實驗利用HPLC-DAD-ESI-MS建立了進口西拉葡萄酒乙酸乙酯提取物的特征指紋圖譜分析方法，使用二極管陣列檢測器和電噴霧質(zhì)譜同步的對目標(biāo)化合物中單體酚類化合物進行定量、定性分析，方法簡便、可操作性強、穩(wěn)定性好和靈敏高，生成的特征指紋圖譜能夠有效地對進口西拉葡萄酒成分進行分析評定和質(zhì)量評價。

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