汪 慧，江 濤，唐 勇，鄒永德，江天久,

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.南海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢測中心，廣東 佛山 528200）

對環(huán)境和食品中的重金屬檢測方法我國均有相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)，但這些傳統(tǒng)的檢測方法都存在樣品處理耗時較長，需大型檢測儀器和專業(yè)人員操作等問題[1-10]。酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測技術(shù)因其高效靈敏、操作簡便等特點(diǎn)[11-12]，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域，免疫學(xué)檢測重金屬的方法正在不斷開發(fā)完善中[13-14]。免疫學(xué)檢測對試樣有一定的要求，只能在液態(tài)環(huán)境中進(jìn)行[15]。為滿足本課題組已開發(fā)出的檢測銅、鉛和鎘的試劑盒（條）[16-21]需要，研究稀酸浸提水產(chǎn)品重金屬銅、鉛、鎘的方法，以利于ELISA檢測技術(shù)在水產(chǎn)品重金屬檢驗(yàn)中的應(yīng)用。稀酸浸提法具有快速高效、簡單易行的特點(diǎn)，可作為傳統(tǒng)樣品前處理的輔助手段應(yīng)用于樣品的初篩，對快速檢測環(huán)境和食品中的重金屬污染物具有很高的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣（Ostrea rivularis）、翡翠貽貝樣品（Perna viridis）、基圍蝦（Metapenaeus ensi） 市售。

鉛、銅、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液（均為1 000 μg/mL） 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；濃HNO3（優(yōu)級純）、濃H2SO4（優(yōu)級純）、濃HCl（優(yōu)級純）、氫氧化鈉（分析純） 天津化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

MDS-6微波消解儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；Optima 7000 DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國PE公司；AL104電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；5424R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 近江牡蠣樣品的制備

選擇100 只體質(zhì)量相差±10%左右的近江牡蠣，清除附著物并洗刷干凈，參照NY 5052—2001《無公害食品：海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》和相關(guān)文獻(xiàn)[22-24]報道，配制海水中重金屬銅、鉛、鎘質(zhì)量濃度分別為100、200、25 μg/L。室溫條件下，將牡蠣置于上述海水的水池中暫養(yǎng)，期間不投餌，晝夜連續(xù)充氣以保證水中溶氧充足。隔天換水并將死掉的牡蠣清出，暴露10 d后，從水池中取出牡蠣，去殼，取出軟體組織并用濾紙將水吸凈，攪拌機(jī)攪碎，裝入聚乙烯袋中，－20 ℃保存。

1.3.1.2 翡翠貽貝樣品的制備

選擇200 只體質(zhì)量相差±10%左右的翡翠貽貝，參照上述方法將其暴露于水池中暫養(yǎng)，7 d后取出，去殼，取出軟體組織并用濾紙將水吸凈，攪拌機(jī)攪碎，裝入聚乙烯袋中，－20 ℃保存。

1.3.1.3 基圍蝦樣品的制備

在玻璃缸中放入一定量自來水，爆氣4 d后加入重金屬污染液。據(jù)GB 11607—1987《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》及參考文獻(xiàn)[25-26]配制水中重金屬銅、鉛和鎘質(zhì)量濃度分別為0.350、0.05、0.015 mg/L。選擇100 只體質(zhì)量相差±10%左右的基圍蝦放入上述缸中暫養(yǎng)，每天喂食兩次，連續(xù)充氣以保證水體溶氧充足。15 d后從水池中取出基圍蝦，取出軟體組織并用濾紙將水吸凈，攪拌機(jī)攪碎，裝入聚乙烯袋中，－20 ℃保存。

1.3.2 微波消解樣品前處理方法

取勻漿處理后的近江牡蠣、翡翠貽貝和基圍蝦組織4 份，每份0.5 g左右，分別置于高壓消解罐內(nèi)，加入5 mL濃HNO3，室溫放置過夜后，放入微波消解爐內(nèi)消解，消解條件（表1）所示，趕酸，定容至10 mL，電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasmaatomic emission spectrometer，ICP-AES）檢測重金屬的濃度。

1.3.3 稀酸浸提樣品前處理法

取上述樣品的勻漿組織各0.5 g，分置于50 mL的離心管中。加入稀酸（鹽酸、硝酸和硫酸）5 mL，浸泡反應(yīng)。設(shè)置酸濃度分別為0.1、0.5、1、2 mol/L和4 mol/L，反應(yīng)時間分別為5、10 、15 、20 、25 min和30 min，反應(yīng)溫度分別為4、10、20、25、30、40、60 ℃和90 ℃。反應(yīng)完畢后，將離心管在8 000 r/min離心10 min，取上清液，ICP檢測上清液中銅、鉛、鎘的含量，確定最佳反應(yīng)條件，每處理組3 個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀酸浸提條件

2.1.1 鹽酸浸提條件

圖1 鹽酸浸提條件Fig.1 Effects of dilute HCl extraction conditions on the extraction efficiencies of three heavy metals

鹽酸浸提近江牡蠣、翡翠貽貝和基尾蝦中銅、鉛和鎘時，隨著鹽酸濃度的升高，浸提液中重金屬的量也逐漸增加，當(dāng)鹽酸濃度為2 mol/L，3 種重金屬的浸提量最大（圖1a）；反應(yīng)時間對鹽酸浸提近江牡蠣和翡翠貽貝中的銅、鉛、鎘影響不大，當(dāng)反應(yīng)時間為10 min時，浸提基圍蝦中的銅、鉛、鎘達(dá)最大（圖1b）；反應(yīng)溫度對鹽酸浸提基圍蝦中的銅影響較大，但對浸提貝類中的重金屬影響不大，當(dāng)溫度20 ℃時，3 種樣品中的重金屬浸提量均可達(dá)最大值，并在20～90℃的溫度范圍內(nèi)基本不變（圖1c）。因此，鹽酸浸提水產(chǎn)品中重金屬污染物條件應(yīng)為濃度2 mol/L、反應(yīng)時間10min、溫度范圍20～90 ℃。

2.1.2 硫酸浸提條件

硫酸浸提近江牡蠣、翡翠貽貝和基尾蝦中銅、鉛和鎘時，隨著硫酸濃度的增大，浸提量逐漸增加，當(dāng)硫酸的濃度為2 mol/L，3 種重金屬的浸提量達(dá)最大（圖2a）；反應(yīng)時間對硫酸浸提基圍蝦中的銅、鉛、鎘及近江牡蠣中的銅影響較大，當(dāng)反應(yīng)時間為15 min時，各樣品的重金屬浸提量達(dá)到最大（圖2b）；反應(yīng)溫度對硫酸浸提翡翠貽貝中的鎘和基圍蝦中的銅影響較大，對其他樣品則影響不大，當(dāng)溫度為10 ℃時，3 種樣品中的重金屬浸提量均可達(dá)最大值，并且在10～90 ℃的范圍內(nèi)浸提液量基本不變（圖2c）。硫酸的最適浸提條件為濃度2 mol/L、反應(yīng)時間10 min、溫度范圍10～90 ℃。

圖2 硫酸浸提條件Fig.2 Effects of dilute H2SO4 extraction conditions on the extraction efficiencies of three heavy metals

2.1.3 硝酸浸提條件

硝酸浸提近江牡蠣、翡翠貽貝和基尾蝦中銅、鉛、鎘時，隨著硝酸濃度的增大，浸提量逐漸增加，當(dāng)硝酸的濃度為2 mol/L，3 種重金屬的浸提量達(dá)最大（圖3a）；反應(yīng)時間對硝酸浸提近江牡蠣中的銅和鎘、基圍蝦中的鉛和翡翠貽貝中的鎘影響較大，當(dāng)反應(yīng)時間為15min時，各樣品的重金屬浸提量達(dá)到最大（圖3b）；反應(yīng)溫度對硝酸浸提近江牡蠣和基圍蝦中的銅及翡翠貽貝中的鎘影響較大，對其他樣品則影響不大，當(dāng)反應(yīng)溫度為10 ℃時，3 種樣品中的重金屬浸提量均可達(dá)最大，并且在10～90 ℃的溫度范圍內(nèi)基本不變（圖3c）。硝酸的浸提條件為濃度2 mol/L、反應(yīng)時間15 min、溫度范圍10～90 ℃。

圖3 硝酸浸提條件Fig.3 Effects of dilute HNO3 extraction conditions on the extraction efficiencies of three heavy metals

2.2 稀酸浸提法與微波消解法比較

分別用上述稀酸浸提和微波消解法，提取上述水產(chǎn)品中的重金屬銅、鉛和鎘，ICP-AES檢測，統(tǒng)計兩種提取法的檢測結(jié)果及比值（表2）。

表2 重金屬不同提取方法的比較Table 2 Comparisons of different extraction methods

我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)對水產(chǎn)品中的銅、鉛、鎘金屬離子限定值10－6數(shù)量級，而ELISA對其的檢測限可達(dá)10－9數(shù)量級，故作為一種用于現(xiàn)場或室內(nèi)樣品快速掃描的樣品前處理技術(shù)，如果其處理效果與微波消解法相比，能為后者的60%以上即可滿足檢測的實(shí)際需要。由表2可知，對近江牡蠣而言，稀鹽酸、稀硫酸、稀硝酸對近江牡蠣中的銅、鉛、鎘的浸提液濃度與微波消解法的比值都能達(dá)到80%，基本可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的微波消解法。同樣與微波消解相比，稀鹽酸浸提基圍蝦中的銅和鎘的比值分別為51.18%、53.25%，稀硫酸浸提翡翠貽貝中的鉛和基圍蝦中的銅的比值分別為52.63%、54.03%，而稀硝酸的比值均能達(dá)到60%，故稀硝酸的浸提效果要比稀鹽酸和稀硫酸的好。

2.3 加標(biāo)回收率

采用加標(biāo)回收驗(yàn)證的方法證明稀酸浸提法的可行性。表3顯示，微波消解法處理水產(chǎn)品中重金屬銅、鉛、鎘的加標(biāo)回收率為93%～118%，稀鹽酸浸提法的加標(biāo)回收率為69%～97%，比微波消解法的低；稀硫酸浸提法的加標(biāo)回收率為97%～116%，比國標(biāo)法的稍高；稀硝酸浸提法的加標(biāo)回收率為98%～111%，比微波消解法的加標(biāo)回收率相當(dāng)。稀鹽酸浸提法低，可能是因?yàn)辂}酸的揮發(fā)性比較強(qiáng)的原因，稀硝酸和稀硫酸的結(jié)果可靠，采用國標(biāo)法提取蛋白質(zhì)類食品中的重金屬，易使重金屬元素?fù)p失，使測定結(jié)果偏小，而且微波消解中使用了濃酸，濃酸的純度對空白值的影響很大，直接影響到測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，所以稀硝酸和稀硫酸浸提法不僅可行而且具有簡便、快速的優(yōu)勢。

這是因?yàn)槲覈狈降貐^(qū)冬季室外溫度通?？梢赃_(dá)到零下，室內(nèi)由于使用火爐、暖氣等，則溫度一般會在20℃左右。內(nèi)外較大的溫度差異，導(dǎo)致建筑在使用過程中，冷空氣、熱空氣一旦相遇，就很容易形成一些吸附在墻體表面的水霧。

表3 微波消解法與稀酸浸提法的加標(biāo)回收率Table 3 Comparison of the spiked recoveries of three heavy metals with microwave digestion and dilute acid extraction methods

2.4 鎘的稀酸浸提液ICP-AES與ELISA檢測結(jié)果比較

圖4 鎘的稀酸浸提-ICP-AES檢測法與稀酸浸提-ELISA檢測法測定結(jié)果比較Fig.4 Comparisons of the results obtained by dilute acid extraction combined with ICP-AES or ELISA for Cd concentrations

將水產(chǎn)品中鎘的稀硝酸浸提液離心后，用微量的NaOH將pH值調(diào)至6，分別用ICP-AES法和ELISA法測定，并進(jìn)行比較。圖4表明，兩種方法的檢測結(jié)果具有顯著的相關(guān)性（P＜0.01），回歸方程為：y=1.020 6x＋0.002 1（R2=0.983 3）。由此說明，在ELISA法檢測水產(chǎn)品中重金屬時，稀酸浸提法完全可以達(dá)到其對樣品前處理的要求。

3 結(jié) 論

3.1 稀鹽酸、稀硫酸和稀硝酸浸提水產(chǎn)中的重金屬銅、鉛、鎘的浸提條件相似，最佳浸提濃度均為2 mol/L，反應(yīng)時間分別為10、10、15 min，浸提溫度分別為20～90、10～90、10～90 ℃。浸提所用的酸濃度低，浸提時間短，只需十幾分鐘，浸提溫度范圍寬，適于現(xiàn)場檢測。

3.2 與微波消解樣品前處理的結(jié)果比較，稀硝酸的浸提效果比稀鹽酸和稀硫酸的好，通過加標(biāo)回收率進(jìn)一步驗(yàn)證，稀鹽酸浸提法可行性不高，而稀硫酸和稀硝酸浸提法可行性較高。

3.3 ICP-AES和ELISA對浸提液中鎘濃度的檢測結(jié)果線性相關(guān)性良好，在ELISA法檢測水產(chǎn)品中重金屬時，稀酸浸提法完全可以達(dá)到其對樣品前處理的要求。

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