張海波，李新霞,，孟 磊，趙東升,2，陳 堅(jiān),3

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆比爾兄弟生物技術(shù)有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830011）

大蒜為百合科蔥屬植物蒜（Allium sativumL.）的地下鱗莖，文字記載大蒜藥食兩用已經(jīng)有數(shù)千年歷史[1]。在古埃及、印度、歐洲等地的許多國家和地區(qū)，藥用大蒜的歷史長遠(yuǎn)而經(jīng)久不衰，并且還在不斷擴(kuò)大[2-3]。1985年前后發(fā)現(xiàn)大蒜除抗感染作用之外，還具有防治心腦血管疾病及抗腫瘤等功效，大蒜成為世界發(fā)達(dá)國家研究的熱點(diǎn)[4]。目前國內(nèi)外公認(rèn)的大蒜活性成分為含硫氨基酸——蒜氨酸在蒜酶催化下產(chǎn)生的大蒜辣素及一系列分解產(chǎn)物[5]。

由于大蒜的功效作用，作為保健品和藥品，大蒜及其制劑在國內(nèi)外非常暢銷，美國藥典、歐洲藥典及中國藥典均收載了大蒜及相關(guān)品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6-8]，其中有的以蒜氨酸為質(zhì)控指標(biāo)之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。國內(nèi)外有關(guān)蒜氨酸分離純化研究的報(bào)道較少，但隨著大蒜功效作用研究及制劑開發(fā)取得一定進(jìn)展，國內(nèi)外對蒜氨酸研究越來越熱。美國已有藥典對照品出售，但價(jià)格昂貴，測試成本太高，且國內(nèi)購買不便；在國內(nèi)雖有一些公司已經(jīng)自制了較高純度的蒜氨酸，但均未得到國家標(biāo)準(zhǔn)委的認(rèn)證，不是法定對照品，質(zhì)量良莠不齊，同樣也無法滿足新藥申報(bào)的要求。為了確保測試結(jié)果的可靠性、可比性和溯源性，規(guī)范大蒜及相關(guān)產(chǎn)品的檢測與質(zhì)量控制、檢測方法評(píng)定，蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制尤為重要。前期，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司聯(lián)合新疆醫(yī)科大學(xué)直接從新疆優(yōu)質(zhì)大蒜中提取純化天然蒜氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，完成了蒜氨酸的提取、分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定[9]，并申請了3 項(xiàng)發(fā)明專利[10-12]，填補(bǔ)了國內(nèi)空白，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對其進(jìn)行定值研究。

圖1 蒜氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of alliin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；三氟乙酸（分析純） 中國吳江桃源試劑廠；去離子水由超純水機(jī)制取。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀（配有2489紫外檢測器和Empower3液相工作站） 美國Waters公司；Milli-Q超低有機(jī)物超純水機(jī) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

鮮蒜經(jīng)滅酶、打漿，有機(jī)溶劑萃取，離心過濾，萃取液濃縮，通過離子交換柱層析，洗脫液濃縮，冷凍干燥得到50%的蒜氨酸粗產(chǎn)品。50%蒜氨酸經(jīng)乙醇重結(jié)晶得到90%的蒜氨酸。以90%的蒜氨酸為原料，經(jīng)丙酮與乙醇兩個(gè)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行重結(jié)晶和純化，獲得蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜和旋光度結(jié)果證明分離制備所得單體為蒜氨酸，初步分析純度達(dá)99%以上。將上述制得蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在潔凈臺(tái)經(jīng)研磨混勻后，用棕色瓶進(jìn)行分裝，按照25 mg/瓶進(jìn)行分裝，編號(hào)后置于冰箱0～4 ℃密封貯藏，以備進(jìn)一步按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的技術(shù)規(guī)范對其進(jìn)行均勻性檢測、穩(wěn)定性檢測及定值研究[13-18]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.2.1 蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備

將蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品置于真空干燥箱中，真空度－0.8 bar、干燥溫度60 ℃、減壓干燥4 h。精密稱取蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品約10.00 mg于5 mL容量瓶中，流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，即得高質(zhì)量濃度蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液；流動(dòng)相稀釋得低質(zhì)量濃度蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02%三氟乙酸（5∶95，V/V）；檢測波長：214 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35℃。此條件已經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證[9]。

1.3.3 樣品均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)抽取10 瓶樣品，對樣品中蒜氨酸進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，每瓶樣品各抽取3 份子樣，每個(gè)子樣分別按照1.3.2.1節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，并用高效液相色譜法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以此評(píng)估樣品的均勻性。

1.3.4 樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)

考察蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4 ℃貯存條件下的長期穩(wěn)定性，歷時(shí)43 個(gè)月，穩(wěn)定性檢驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)是在每個(gè)穩(wěn)定性檢驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)（0、1、3、6、9、12、43 個(gè)月）從庫存樣品中隨機(jī)抽取3 瓶樣品，每瓶樣品平行分析2 次，并以3 瓶樣品的總平均值為該時(shí)間點(diǎn)特性值穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果。對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以此評(píng)估樣品的穩(wěn)定性。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值

選擇9 家有能力的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品比對，分別用LAB 01～LAB 09編號(hào)表示。9 家實(shí)驗(yàn)室通過實(shí)驗(yàn)室間協(xié)作定值計(jì)劃，隨機(jī)抽取樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送2 瓶。蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品協(xié)作測定研究要求各實(shí)驗(yàn)室按照作業(yè)指導(dǎo)書要求開展協(xié)作定值分析工作。嚴(yán)格按照企業(yè)所附方法進(jìn)行樣品的儲(chǔ)存、處理、測定，應(yīng)用高效液相色譜面積歸一法進(jìn)行定值，出具測試報(bào)告。對各定值實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的協(xié)作測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度的定值方法

圖2 蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatogram of alliin Certified reference material

前期以美國蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)對照品計(jì)算此蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為99.00%[9]，滿足選擇高效液相色譜面積歸一化法進(jìn)行有機(jī)化合物純度定值的條件；并且經(jīng)二極管陣列檢測器200～400 nm掃描，主要雜質(zhì)光譜與蒜氨酸光譜一致，即雜質(zhì)與主成分響應(yīng)接近，因此應(yīng)用高效液相色譜面積歸一法確定蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度是合理可行的[19-20]，即主峰面積占色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積的百分率。按1.3.2.1節(jié)方法配制蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖2）。高質(zhì)量濃度時(shí)，蒜氨酸峰為平頭峰，對應(yīng)的峰面積可由低質(zhì)量濃度時(shí)對應(yīng)的峰面積根據(jù)質(zhì)量濃度倍率關(guān)系求出，此時(shí)雜質(zhì)峰面積較大，測量誤差較小。

2.2 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

表1 蒜氨酸樣品的均勻性檢測數(shù)據(jù)Table 1 Results of homogeneity testing for alliin %

采用F檢驗(yàn)對蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品均勻性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（表1）進(jìn)行處理，得組間均方：MS間=0.037；組內(nèi)均方：MS內(nèi)=0.001。所以，方法重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：瓶間均勻性標(biāo)準(zhǔn)偏差：（每瓶測定次數(shù)均為3 次，n0=3）；不均勻性不確定度：0.08。蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品通過比較瓶間均勻性不確定度（ubb）和均勻性檢驗(yàn)分析方法重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（sr）的大小對抽檢特性的均勻性進(jìn)行評(píng)估。ubb與sr相近，可認(rèn)為被抽檢特性均勻。

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

表2 蒜氨酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Long-term storage stability of alliin

由表2可知，蒜氨酸含量在檢驗(yàn)期內(nèi)未見明顯的變化趨勢；根據(jù)紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜、旋光度和元素分析數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)值[9]比對，均符合文獻(xiàn)值，表明實(shí)驗(yàn)期間蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保持穩(wěn)定并未發(fā)生改變。對穩(wěn)定性檢驗(yàn)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在觀察沒有明顯穩(wěn)定性變化趨勢存在時(shí)，可采用一元線性擬合方程模型為穩(wěn)定性研究基本模型。在一元線性回歸方程中，如果斜率的估計(jì)值（b1）等于零，即說明時(shí)間（X）與標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值（Y）之間不存在線性關(guān)系。這可以通過統(tǒng)計(jì)方法（t檢驗(yàn)法）對X與Y之間是否存在線性關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。得斜率的估計(jì)值：截距的估計(jì)值：斜率標(biāo)準(zhǔn)偏差的估計(jì)值：t計(jì)算值：t檢驗(yàn)臨界值：t臨界=2.447。通過比較t計(jì)算值（tcal）與t檢驗(yàn)臨界值（t臨界）的大小評(píng)估抽樣特性的穩(wěn)定性，tcal小于t臨界，可認(rèn)為蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品中蒜氨酸的測定值與檢驗(yàn)時(shí)間形成的直線斜率不顯著，因而抽檢特性在檢驗(yàn)期間是穩(wěn)定的。

有效期t=43 個(gè)月的長期穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)為：

2.4 定值結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的協(xié)作定值分析結(jié)果報(bào)告中，用格拉布斯準(zhǔn)則從統(tǒng)計(jì)上剔除可疑值，再用科克倫準(zhǔn)則檢查各組數(shù)據(jù)之間是否等精度，確定所有結(jié)果均可接受，本研究原則上將不剔除任何一個(gè)結(jié)果，而是全部參與統(tǒng)計(jì)計(jì)算。對所有有效數(shù)據(jù)，分別計(jì)算協(xié)作測定的總均值（）、總均值標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）和總均值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）、測定不確定度（uchar）和相對測定不確定度（相對uchar）。蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品協(xié)作測定研究計(jì)算結(jié)果匯總于表3。

表3 蒜氨酸的定值結(jié)果Table 3 Certified values of alliin

用t分布法估計(jì)總體均數(shù)，9 5%置信區(qū)間為99.49±0.21；測定不確定度分量uchar=0.092 8，同蒜氨酸單體樣品的均勻性檢驗(yàn)中求得的瓶間均勻性不確定度ubb=0.080 0，及蒜氨酸單體樣品的穩(wěn)定性檢驗(yàn)中求得的長期穩(wěn)定性不確定度ults=0.946，一并代入量值評(píng)定基本模型得特性值的合成不確定度uc=0.95%；按評(píng)定特性值為（99.49±0.95）%。

3 結(jié) 論

本研究制備的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過了均勻性及穩(wěn)定性檢驗(yàn)，均勻性良好，且穩(wěn)定期不少于43 個(gè)月。9 家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值后，蒜氨酸特性值為（99.49±0.95）%?，F(xiàn)已上報(bào)國家標(biāo)準(zhǔn)委，通過審評(píng)并獲得蒜氨酸國家標(biāo)準(zhǔn)樣品證書（GSB 11-3079—2013），這對規(guī)范大蒜及相關(guān)產(chǎn)品的檢測與質(zhì)量控制、檢測方法評(píng)定具有重要意義，可以保證分析測試質(zhì)量，且測試結(jié)果具有可溯源性、準(zhǔn)確性與合法性。

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