劉 靜，李湘利，孔 嫻，梁寶東，胡彥營

（濟寧學院生命科學與工程系，山東 曲阜 273155）

膳食纖維（dietary fiber，DF）是一類不為人體消化和利用的非淀粉多糖，包括可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩大類[1]。一般而言，SDF比IDF的生理功能更強，如持水率高，促進胃腸蠕動，降低膽固醇等[2-3]。SDF提取方法主要有化學法[4]、酶法[5]、酶-化學結合法[4]、微波法[6]、超聲波法[7]。超聲波處理可在物料內部產生強烈的振動和強大的空化效應，降低植物組織中各成分之間結合的緊密程度[3]。將超聲波應用到酶法提取SDF中，可提高SDF得率，縮短提取時間[8]。

香椿（Toona sinensis(A.Juss.) Roem）為楝科香椿屬落葉喬木，因其嫩芽有特殊香氣而得名[9]。香椿老葉是香椿的副產物，產量明顯高于嫩芽，因老葉營養(yǎng)價值降低、口感變差而被摒棄[10]。據(jù)測定[11]，香椿老葉含粗蛋白17.63%、粗纖維15.18%，并含有豐富的礦物質和氨基酸；如加以開發(fā)和利用，開展功效成分的提取，可明顯延長香椿產業(yè)鏈[12-13]。為此，本實驗利用超聲波協(xié)同酶法制備提取了香椿老葉SDF，并對提取條件進行了優(yōu)化，旨在豐富膳食纖維的原料來源，為香椿老葉的綜合利用與功能性食品的開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香椿老葉，2012年9月采自本校教職工生活區(qū)；中性蛋白酶（40萬U/g） 南寧龐博生物工程公司；纖維素酶（10萬U/g） 湖州米純生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、碳酸氫鈉、磷酸、考馬斯亮藍G-250等均為分析純；牛血清白蛋白（純度≥98%）。

1.2 儀器與設備

TD6低速離心機 長沙英泰儀器有限公司；pHS-3C酸度計 上海宇隆儀器有限公司；FA2004N電子天平上海精密儀器有限公司；HH-S24S數(shù)顯恒溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械廠；FCD2000鼓風干燥箱 上?，槴\實驗設備有限公司；2H-25C多功能食品加工機 澳柯瑪小家電有限公司；KH2200DV數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SZF-06C粗脂肪測定儀 浙江托普儀器有限公司；ZKH2000快速灰化爐 鶴壁智勝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香椿老葉預處理

香椿老葉于60 ℃烘干后粉碎過40 目篩，加入4 倍體積的乙醚，于室溫條件下攪拌2 h，過濾收集殘渣，再加4 倍體積80%乙醇溶液，4 倍體積水分別洗滌，干燥后即得香椿老葉干粉。

1.3.2 香椿老葉SDF的提取工藝

香椿老葉（干品）→預處理→干燥→稱質量→調pH 6.0→中性蛋白酶酶解→超聲波輔助纖維素酶酶解→滅酶（100 ℃、5 min）→冷卻→離心（4 000 r/min、10 min）→上清液→洗滌（兩次）→上清液→乙醇沉淀（95%乙醇、2 h）→離心（4 000 r/min、5 min）→沉淀→78%乙醇洗滌→干燥→SDF

1.3.3 試驗設計

香椿老葉干粉按料水比1∶15混合，結合預實驗結果，添加0.2%中性蛋白酶于60 ℃酶解2 h后，加入纖維素酶并采用超聲波輔助提取，固定超聲波功率為100 W[8]。選取纖維素酶添加量、pH值、超聲溫度、超聲時間4 個因素進行SDF提取的單因素試驗。在纖維素酶添加量0.5%、pH 6.0、超聲溫度60 ℃處理50 min的條件下，改變試驗因素，研究各因素對香椿老葉SDF提取率的影響。結合單因素試驗結果，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原則，應用響應面法優(yōu)化SDF提取條件。

1.3.4 SDF提取率的測定

參照吳素蕊等[14]的方法。

1.3.5 化學成分的測定

水分含量的測定：采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中直接干燥法；灰分含量的測定：采用GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》中直接灰化法；脂肪含量的測定：采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法；蛋白質含量的測定：采用考馬斯亮藍結合法[15]；淀粉含量的測定：采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》中酸水解法；SDF含量的測定：采用酶-重量法[16]。

1.3.6 持水力的測定

根據(jù)李娜等[17]的方法略做改動。稱取1.00 g樣品于100 mL燒杯中，加入75 mL蒸餾水，攪拌2 h，在3 000 r/min離心30 min，除去上清液后稱取質量，計算持水力。

1.3.7 膨脹力的測定

稱取1.00 g樣品于20 mL量筒中，測定體積后，加入10 mL蒸餾水，浸泡24 h并測定體積，計算膨脹力[18]。

1.3.8 結果統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0軟件進行單因素試驗結果統(tǒng)計分析，應用Design Expert 8.0.7軟件的Box-Behnken試驗設計建立數(shù)學模型，并進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 香椿老葉SDF提取單因素試驗

2.1.1 纖維素酶添加量對SDF提取率的影響

圖1 酶添加量對SDF提取率的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage on the extraction rate of SDF

由圖1可知，隨纖維素酶添加量的增加，SDF提取率顯著升高，酶添加量為0.5%時SDF提取率最高可達6.61%（P＜0.05）。隨著酶用量的繼續(xù)增加提取率反而下降，這是因為纖維酶可加速SDF溶出，提高SDF提取率；但過量添加纖維素酶會降低SDF聚合度，使提取率下降[5]。故宜選擇纖維素酶添加量在0.5%左右。

2.1.2 pH值對SDF提取率的影響

圖2 pH值對SDF提取率的影響Fig.2 Effects of pH on the extraction rate of SDF

由圖2可知，隨pH值增加，SDF提取率逐漸升高，尤以pH 6.0時，SDF提取率最高為6.87%（P＜0.05）；pH值高于6.0時，SDF提取率反而降低。這可能是pH值影響了纖維素酶活性[19]，在pH 6.0條件下該酶活性較強，提取率較高?？梢姡x擇pH 6.0左右進行酶解較為合適。

2.1.3 超聲溫度對SDF提取率的影響

圖3 超聲溫度對SDF提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonication temperature on the extraction rate of SDF

由圖3可知，SDF提取率隨溫度的升高呈現(xiàn)一鐘型變化曲線，60 ℃時提取率最高可達6.98%，與其他處理差異顯著（P＜0.05）。這是因為高溫可使酶活性減弱，降低了SDF提取率；另外，超聲溫度升高會增加不同分子間的布朗運動，從而利于SDF的提?。坏珳囟冗^高會使溶劑汽化，不利于提取[3]。因此，選擇超聲溫度60 ℃左右較適宜。

2.1.4 超聲時間對SDF提取率的影響

圖4 超聲時間對SDF提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonication time on the extraction rate of SDF

由圖4可知，超聲處理50 min時，SDF提取率最高可達7.05%（P＜0.05）；隨著時間的延長，SDF提取率反而下降。因為超聲波能在物料內部產生強烈的振動、極高的加速度和強大的空化效應，對植物細胞和分子間的作用明顯，從而提高提取率；隨超聲時間的延長，SDF結構會被破壞，致使SDF提取率下降[8]。故選擇超聲時間50 min左右為宜。

2.2 香椿老葉SDF提取的響應面優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗因素水平的選取及結果

結合單因素試驗結果，以纖維素酶添加量（X1）、pH值（X2）、超聲溫度（X3）、超聲時間（X4）為自變量，SDF提取率（Y）為響應值，設計四因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和SDF提取率之間的函數(shù)關系，采用響應面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。各試驗因素與水平見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface design

表2 響應面分析試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型的建立和顯著性檢驗

利用Design Expert軟件對表2中的結果進行多元回歸擬合，得到SDF提取率對纖維素酶添加量、pH值、超聲溫度、超聲時間的回歸模型：

模型的方差分析（表3）表明，失擬項不顯著（P=0.084 7＞0.05），而模型P＜0.000 1，模型極顯著，模型確定系數(shù)R2=0.932 1，調整確定系數(shù)表明模型能較好地反映各因素與響應值的變化關系，可用于預測實際SDF的提取率。在α=0.05顯著水平上剔除不顯著項，得到簡化方程：

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 主效應分析

各因素的P值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，P值越小，表明該因素對試驗結果影響越大[20]。由表3可知，4 個試驗因素對SDF提取率影響大小依次為超聲時間＞纖維素酶添加量＞pH值＞超聲溫度。

2.2.4 單因素效應分析

將所得回歸方程中的4 個因素任意3 個固定在零水平，可得：

將試驗因素分別固定在－2、－1、0、1、2五個水平[21]，計算各因素不同水平的SDF提取率（Y），并以此作圖，結果見圖5。

圖5 各單因素與SDF提取率的關系Fig.5 Relationship between each variable and extraction rate of SDF

2.2.5 兩因素間交互效應分析

固定任意兩因素在零水平，可得另外兩個因素的雙因素模型。本實驗重點考察pH值和超聲時間的交互作用，利用Design Expert軟件所得響應面及等高線見圖6。

圖6 pH值與超聲時間交互影響SDF提取率的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour plot for the interactive effects of pH and ultrasonication time on the yield of SDF

由圖6可知，pH值與超聲時間之間的相互作用對香椿老葉SDF提取率影響高度顯著。隨著pH值的增大，SDF提取率先增加后降低；隨著超聲時間的增加，SDF提取率先增加后降低；最優(yōu)提取點出現(xiàn)在pH 6.0和超聲時間50 min，此點附近SDF提取率有最大值。

2.2.6 最優(yōu)組合的確定及驗證

利用Design Expert軟件對模型求解，得到香椿老葉SDF最優(yōu)提取條件：纖維素酶添加量0.50%、pH 5.91、超聲時間53.53 min、超聲溫度59.76 ℃，模型預測值為7.13%。為驗證模型的適用性與可靠性，結合實際可操作性，在加酶量0.50%、pH 6.0、超聲時間53.0 min、超聲溫度60.0 ℃進行驗證性實驗，所得SDF平均提取率為7.11%，與預測值基本相符。

2.3 組成成分分析

表4 香椿老葉及產品SDF主要成分含量Table 4 Proximate chemical composition of old leaves of Toona sinensis and SDF extracts thereof %

由表4可知，香椿老葉含有相對較高的脂肪，故實驗預處理時進行了脫脂處理。測定結果表明，除灰分外，產品SDF含雜質較少，說明除雜效果較好。

2.4 SDF功能性質的測定

表5 香椿老葉及產品SDF持水力和膨脹力的測定結果Table 5 Water-holding capacity and expansibility of old leaves of Toona sinensis and SDF extracts thereof

由表5可知，香椿老葉SDF的持水力和膨脹力分別是7.29 g/g、4.40 mL/g，功能性指標超過西方國家麩皮膳食纖維的標準（持水力4.0 g/g、膨脹力4.0 mL/g）[22]?？梢姡崛〉玫降腟DF功能性較好。

3 討論與結論

SDF提取方法很多，傳統(tǒng)方法均有一定的弊端。酸堿法對SDF破壞較大，所得SDF品質較差，環(huán)境污染大[23]。酶法雖提取條件溫和、節(jié)能、利于環(huán)保，所得SDF顏色淺、純度高、易漂白，但單純酶法或單純超聲法提取SDF耗時長，得率低[5,24]。而超聲波協(xié)同酶法提取SDF在一定程度上提高了得率，縮短了提取時間，所得SDF品質較好[3,8]。

本實驗應用響應面設計和超聲波輔助技術，結合酶法對香椿老葉SDF提取的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。不同因素對香椿老葉SDF提取率影響的主次順序依次為超聲時間＞纖維素酶添加量＞pH值＞超聲溫度。通過響應面優(yōu)化SDF提取最優(yōu)條件為纖維素酶添加量0.50%、pH 6.0、超聲時間53.0 min、超聲溫度60.0 ℃，香椿老葉SDF提取率可達7.11%。此工藝條件提取得到的香椿老葉SDF，除灰分外，雜質含量較少，SDF持水力為7.29 g/g，膨脹力為4.40 mL/g，功能性質較好。所得SDF呈淡黃色，無特殊氣味，具有良好的生理活性，可作為功能性食品基料添加到面包、飲料、乳制品、餅干等食品中，既可增加食品的保健功能，又提高了香椿采后附加值，具有廣闊的市場前景。

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