陳 虎，蒲俊松，向仲懷，何寧佳

（家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

藥桑（Morus nigraLinn.），屬桑科桑屬黑桑種，起源于伊朗，16世紀(jì)在我國(guó)新疆等地開(kāi)始栽培，是我國(guó)唯一的黑桑種，目前也主要分布于新疆阿克蘇、和田、吐魯番和喀什等地區(qū)[1-4]。藥桑葚為其成熟果實(shí)，含多種營(yíng)養(yǎng)和藥用成分，為維吾爾族歷代的民間藥材，具有消炎鎮(zhèn)痛等藥效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)藥桑葚還具有降三高（血糖、血脂、血壓）、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，植物化學(xué)研究表明藥桑葚含有黃酮、多糖、生物堿、二苯乙烯類等多種活性成分[5-9]。黃酮類化合物有很強(qiáng)的抗氧化和自由基清除能力，藥理活性則表現(xiàn)在抗衰老、防癌變、降低膽固醇、提高免疫力等方面[10-14]。

響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[15]，與傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法相比，具有高效、全面和回歸方程精度更高等優(yōu)勢(shì)，目前已在生物學(xué)、食品學(xué)、工程學(xué)、化學(xué)工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[16-19]。

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化藥桑葚總黃酮的提取工藝，在此基礎(chǔ)上研究其還原力及抗氧化活性，以期為藥桑葚總黃酮的提取以及開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藥桑葚采自新疆和田蠶研所桑樹(shù)種質(zhì)資源圃，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，置干燥器中備用。

蘆?。兌取?2.5%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；VC（純度≥98%） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑皆為分析純。

DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CT15RE冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；UV1000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[20]

精密稱取干燥恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中（超聲波助溶），搖勻制備質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液稀釋至5.0 mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液4.0 mL，使用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容，搖勻。以空白試劑為參比液，波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程為：y=13.116x-0.004 3，R2=0.999 5。

1.2.2 藥桑葚總黃酮提取及含量的測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取桑葚干粉2 g于50 mL離心管中，按一定料液比的乙醇溶液，一定功率超聲和一定時(shí)間提取總黃酮。提取液在20 ℃條件下8 000 ×g轉(zhuǎn)速離心5 min，濾渣以同樣條件提取、離心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容為80 mL溶液。取定容后樣品各0.6 mL檢測(cè)，用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法測(cè)定藥桑葚總黃酮的含量，即為得率。

1.2.3 篩選影響藥桑葚總黃酮提取主要因素

表1 超聲提取藥桑葚總黃酮二位級(jí)正交試驗(yàn)因素表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

利用二位級(jí)正交試驗(yàn)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為6 個(gè)考察因素，選取兩個(gè)位級(jí)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，篩選出影響藥桑葚總黃酮提取主要因素，因素位級(jí)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2.4 還原力測(cè)定[21-22]

普魯士蘭法測(cè)定樣品的還原力：取一定體積（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL）的樣品液于10 mL棕色容量瓶中，加入質(zhì)量濃度10 mg/mL的鐵氰化鉀和PBS（pH 6.5）溶液各1.0 mL，搖勻，混合液于50 ℃水浴20 min，加入1.0 mL質(zhì)量濃度100 mg/mL的三氯乙酸溶液，搖勻，靜置10 min后，再加入質(zhì)量濃度1 mg/mL的三氯化鐵與蒸餾水各1.0 mL，無(wú)水乙醇定容，靜置10 min，分光光度計(jì)于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 羥自由基清除率測(cè)定[23-24]

取6 支10 mL離心管依次向其中各加入2.0 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、1.0 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，搖勻,再加入6.0 mmol/L水楊酸3.0 mL，搖勻，于37 ℃水浴加熱15 min。水浴完畢取一支離心管于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。之后向余下5支試管中分別加入待試樣品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，接著分別添加超純水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，待加熱完畢后再次分別測(cè)定吸光度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用2.0 mL蒸餾水取代H2O2溶液，嚴(yán)格重復(fù)上述過(guò)程，測(cè)吸光度。重復(fù)3次，取平均值。羥自由基清除率計(jì)算見(jiàn)式（2）。

式中：A0為空白對(duì)照溶液吸光度；Ax為樣品液吸光度；Ax0為不加H2O2樣品液的本底吸光度。

1.2.6 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定[23,25]

取6 支10 mL離心管各加入pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1緩沖液4.5 mL，再分別加入待測(cè)樣0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，然后依次加蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（10 mmol/L HCl溶液配制）啟動(dòng)反應(yīng)。5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 mL終止反應(yīng)。同時(shí)另取6支離心管，按上述步驟依次加入Tris-HCl緩沖液、總黃酮提取液和蒸餾水，然后分別加10 mmol/L鹽酸溶液0.3 mL，5 min后加10 mol/L鹽酸溶液0.2 mL終止反應(yīng)，搖勻。在325 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。按照式（3）計(jì)算藥桑葚總黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響藥桑葚總黃酮提取主要因素

按表1的正交因素水平設(shè)計(jì)L8（27）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 超聲提取藥桑葚總黃酮工藝L8（27）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of L8(27) orthogonal array

由表2的極差分析結(jié)果可得，RA＞RD＞RF＞RE＞RC=RB，因此，藥桑葚總黃酮提取因素的影響力大小為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞提取溫度（D）＞提取次數(shù)（F）＞提取時(shí)間（E）＞超聲功率（C）=料液比（B）。對(duì)提取率影響最顯著的是乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)3 個(gè)因素。

2.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果（表2），設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)3 個(gè)影響藥桑葚總黃酮提取的主要因素的單因素試驗(yàn)，次要因素選取提取時(shí)間15 min、超聲功率500 W、料液比1∶10。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藥桑葚總黃酮得率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，藥桑葚總黃酮得率也隨之增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)總黃酮得率最大，隨后得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。這可能是因?yàn)?0%乙醇的極性與藥桑葚黃酮類化合物極性最相近，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于或高于50%時(shí)，藥桑葚黃酮類成分未充分溶出，或者乙醇低體積分?jǐn)?shù)時(shí)水溶性成分溶出，乙醇高體積分?jǐn)?shù)時(shí)脂溶性成分溶出，影響了黃酮類化合物的溶出。

2.2.2 提取溫度對(duì)藥桑葚總黃酮得率的影響

圖2 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids

由圖2可知，隨著溫度的升高，藥桑葚總黃酮得率在70 ℃達(dá)到最高，出現(xiàn)的波動(dòng)可能因?yàn)闇囟鹊淖兓?，一方面造成黃酮類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散和溶解速度等變化，另一方面也造成已經(jīng)提取出來(lái)的黃酮類成分分解。

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)藥桑葚總黃酮得率的影響

圖3 提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of number of repeated extractions on the extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，隨著提取次數(shù)的增加，藥桑葚黃酮得率逐漸增加，提取3次后變化緩慢，得率較高。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

根據(jù)正交試驗(yàn)因素篩選結(jié)果和單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)對(duì)藥桑葚總黃酮提取影響最大的3 個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析因素水平及編碼Table 3 Coded values and corresponding actual values for independent variables in response surface design

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design with predicted and experimental extraction yield of total flavonoids for response surface analysis

采用Design-Expert軟件經(jīng)回歸擬合后，得到以總黃酮得率為響應(yīng)值的二次回歸方程：

回歸模型方差分析見(jiàn)表5。由表5可知，整體模型的F值為37.68，P值小于0.01，表明二次方程模型極顯著；的P值均小于0.05，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取次數(shù)之積、提取溫度與次數(shù)之積、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)二次項(xiàng)對(duì)藥桑葚總黃酮的得率有顯著影響；失擬項(xiàng)（P=0.145 6）不顯著，方程模擬較好；決定系數(shù)R2=0.979 8，說(shuō)明模型能夠解釋97.98%響應(yīng)值的變化；預(yù)測(cè)擬合度與校正擬合度較接近；變異系數(shù)（CV=0.87%）低，模型置信度高；信噪比為27.034（遠(yuǎn)大于最低要求4），即該模型可用于預(yù)測(cè)。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation

2.3.3 響應(yīng)面分析

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Response surface plot for the effects of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Response surface plot for the effects of ethanol concentration and number of reapted extractions on the yield of total flavonoids

圖6 提取溫度和提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.6 Response surface plot for the effects of extraction temperature and number of repeated extractions on the yield of total flavonoids

由圖4～6可知，對(duì)總黃酮得率的影響最顯著的是乙醇體積分?jǐn)?shù)，然后依次為提取次數(shù)、提取溫度。通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)藥桑葚總黃酮提取的最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)47.64%、溫度80 ℃、提取4次。在此條件下總黃酮得率理論上可達(dá)2.32%。根據(jù)實(shí)際操作的情況，將提取條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、溫度80 ℃、提取4 次，在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮得率平均為2.31%，與預(yù)測(cè)值較為接近，證明響應(yīng)面法分析得到的藥桑葚總黃酮提取條件是真實(shí)可靠的。同時(shí)，考慮到高溫對(duì)化合物穩(wěn)定的影響及多次提取的繁瑣，也可采用以下優(yōu)化條件對(duì)藥桑葚總黃酮進(jìn)行提?。阂掖俭w積分?jǐn)?shù)38%、溫度60 ℃、提取2 次、料液比1:10、超聲時(shí)間15 min/次、超聲功率500 W，預(yù)測(cè)總黃酮得率2.24%，實(shí)測(cè)總黃酮得率2.22%。

2.4 還原力及抗氧化測(cè)定結(jié)果與分析

提取液1為使用最優(yōu)方法（乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，溫度80 ℃，提取4 次），稀釋12 倍，獲得質(zhì)量濃度為0.048 mg/mL的藥桑葚總黃酮提取液；提取液2為使用方法（乙醇體積分?jǐn)?shù)38%、溫度60 ℃、提取2 次），稀釋24 倍，獲得質(zhì)量濃度為0.046 mg/mL的藥桑葚總黃酮提取液；VC為質(zhì)量濃度0.048 mg/mL的乙醇溶液。

2.4.1 還原力

圖7 VC和藥?？傸S酮還原力Fig.7 Reducing power of Vc and total flavonoids from black mulberries

由圖7可知，通過(guò)吸光度比較還原力的大小，隨著總黃酮和VC量的增加還原力逐漸增強(qiáng)，與VC相比，藥桑葚總黃酮還原力更強(qiáng)，還原力：提取液1＞提取液2＞VC。

2.4.2 羥自由基清除率

圖8 VC和藥?？傸S酮羥自由基清除力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of VC and total flavonoids from black mulberries

由圖8可知，提取液1和提取液2對(duì)羥自由基清除力隨加樣體積增加而增強(qiáng)，且清除能力極為相近，并強(qiáng)于VC，羥自由基清除力：提取液1≈提取液2＞VC。

2.4.3 超氧陰離子自由基清除率

圖9 VC和藥桑總黃酮超氧陰離子自由基清除力Fig.9 Superoxide anion radical scavenging activity of VC and total flavonoids from black mulberries

由圖9可知，隨著加樣體積增加，提取液1和提取液2對(duì)超氧陰離子自由基清除力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到0.3 mL時(shí)清除力增強(qiáng)變平緩，兩種方法得到的總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除力極為相近，超氧陰離子自由基清除力：VC＞提取液1≈提取液2。

3 結(jié) 論

3.1 采用超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)藥桑葚總黃酮進(jìn)行提取，通過(guò)正交試驗(yàn)，得到影響藥桑葚總黃酮得率的提取因素的影響力大小：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞超聲功率=料液比。

3.2 通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)藥桑葚總黃酮超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)48%、提取溫度80 ℃、提取4 次、料液比1∶10、提取時(shí)間15 min/次、超聲功率500 W。

3.3 通過(guò)還原力及自由基清除實(shí)驗(yàn)，表明藥?？傸S酮具有較強(qiáng)還原力及自由基清除能力，且對(duì)羥自由基清除力強(qiáng)于超氧陰離子自由基；相對(duì)于最優(yōu)方法，方法2（乙醇體積分?jǐn)?shù)38%、提取溫度60 ℃、提取2次、料液比1∶10、提取時(shí)間15 min/次、超聲功率500 W）溫度相對(duì)溫和，流程簡(jiǎn)易，總黃酮得率較高，還原力及抗氧化力較強(qiáng)，提取藥桑葚總黃酮時(shí)可考慮采用。

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