高雪楠，張 嬋,，尹 勝，張秋晨，王成濤,,，徐寶財(cái),

（1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

木糖醇是甜度最高的糖醇，其甜度相當(dāng)于蔗糖，熱量只有蔗糖的40%，并具有清涼感，因其具有防齲齒、潔齒、潤(rùn)喉、改善胃腸功能等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于口香糖、膠姆糖、太妃糖、軟糖、巧克力、果凍、冷飲、口含片、漱口劑、潤(rùn)喉藥物、止咳糖漿中；木糖醇代謝不需要胰島素調(diào)節(jié)，不會(huì)導(dǎo)致人體血糖的劇烈變化，可作為糖尿病人的甜味劑；木糖醇可促進(jìn)肝糖元合成，減少脂肪和肝組織中蛋白質(zhì)消耗，具有改善肝功能和抗脂肪肝的作用，可作為肝炎、高血壓、高血脂和年老體弱病人的專用輸液劑。近年來，隨著人們生活質(zhì)量提高，木糖醇的健康功效越來越多被消費(fèi)者所接受[1-3]。全球木糖醇年需求量10萬t以上，我是世界木糖醇的主要生產(chǎn)和出口國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量約40%，我國木糖醇年需求量2.5萬t以上。目前木糖醇主要通過化學(xué)合成制造，需使用有毒性的鎳催化劑和高壓氫氣，要求原料木糖的純度高，工藝復(fù)雜、安全性差、生產(chǎn)成本高、副產(chǎn)物成分復(fù)雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，不符合節(jié)能減排、可持續(xù)發(fā)展的社會(huì)要求，成為目前國家嚴(yán)格限制發(fā)展的行業(yè)[4]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌可轉(zhuǎn)化木糖生成木糖醇，該生化過程的原料木糖無需純化制備，反應(yīng)條件溫和，無需耐高壓設(shè)備，此“清潔”、“綠色”的生產(chǎn)技術(shù)成為近年研究熱點(diǎn)[5-7]。木糖醇的生物合成與磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)緊密相連，需要木糖還原酶、還原性輔酶NADPH等參與（木糖＋，此還原反應(yīng)是木糖醇能否順利連續(xù)合成的關(guān)鍵步驟[8-10]，NADPH主要是通過PPP途徑產(chǎn)生，當(dāng)PPP途徑受到破壞，木糖醇產(chǎn)量則明顯降低[11]。關(guān)于增強(qiáng)PPP途徑的代謝通量分配及NADPH的再生，改善PPP途徑以提高木糖醇產(chǎn)率的研究已有一些報(bào)道[12-19]。Kang等[15]研究認(rèn)為，以木糖為底物發(fā)酵時(shí)，PPP途徑的多種酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以葡萄糖為底物時(shí)的情況。Choi等[16]研究認(rèn)為，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose 6-phosphatedehydrogenase，G6PDH）是PPP途徑中催化生成NADPH的關(guān)鍵性調(diào)控限速酶，因此，提高G6PDH的酶活力是增加NADPH供應(yīng)量的有效手段之一。Kwon等[17]將Saccharomyces cerevisiae的G6PDH編碼基因ZWF1導(dǎo)入遺傳改造后含外源木糖脫氫酶基因的釀酒酵母中，改造后重組菌株中G6PDH的酶活力提高了近6倍，發(fā)酵液中木糖醇濃度與只導(dǎo)入木糖脫氫酶基因的菌株相比，木糖醇產(chǎn)率提高了25%，表明導(dǎo)入編碼G6PDH的基因能夠顯著提高木糖醇產(chǎn)率。熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）也是目前木糖醇生產(chǎn)研究廣泛應(yīng)用的菌株[6-7,15-16]。本實(shí)驗(yàn)以Candida tropicalisCT16為模式菌株，將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因G6PDH進(jìn)行克隆、過量表達(dá)，構(gòu)建高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)的木糖醇工程菌株，研究其對(duì)木糖醇合成代謝的影響，為木糖醇生物合成制造提供優(yōu)良菌株和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C.tropicalisCT16 本實(shí)驗(yàn)室保存；Escherichia coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞 天根生化科技（北京）有限公司；酵母表達(dá)載體pYES-pgk 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

酵母基因組提取試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒、抗生素G418 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker北京全式金公司；EXTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨和蛋白胨英國Oxoid公司；木糖山東福田科技集團(tuán)；木糖醇（分析純）美國Sigma公司；NADP+、NADPH 半夏科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani （LB）培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10、酵母提取物5、NaCl 10；YPD （yeast extract peptone dextrose）培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10；木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：木糖100、葡萄糖10、蛋白胨 1、酵母提取物0.5。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中報(bào)道的C.tropicalis葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd編碼序列（Accession No.XM_002548907），利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物。

g6pd基因擴(kuò)增引物：F-g6pd：5’-GG GGT ACC ATG TCT TAT GAT TCA TTC GG-3’（酶切位點(diǎn)KpnⅠ）；R-g6pd：5’-GC TCT AGA TTA GAT CTT ACC TTT GAC AT-3’（酶切位點(diǎn)XbaⅠ）。酵母轉(zhuǎn)化子鑒定引物：F-T7：5’-CAG CTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；R-CYC1：5’-TATAATACCGGTGTTGGCCGATTCATTATT-3’。

1.4 g6pd基因的PCR擴(kuò)增

以C.tropicalisCT16的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物F-g6pd和R-g6pd進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：ExTaq聚合酶0.3 μL、模板2 μL、上下游引物（10 mmol/L）各1 μL、dNTP混合物（2.5 mmol/L）2 μL、10×Ex TaqBuffer 2.5 μL、ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工（生物）工程技術(shù)有限公司測(cè)序，DNAMAN軟件和NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站在線BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列分析和同源性搜索比對(duì)。

1.5 表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd的構(gòu)建

表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd的構(gòu)建如圖1所示。KpnⅠ和XbaⅠ分別對(duì)g6pd基因片段和pYES-pgk進(jìn)行雙酶切，純化回收的酶切片斷經(jīng)T4 DNA Ligase于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞，在添加抗生素G418的LB平板上篩選陽性重組子，37℃培養(yǎng)過夜，提取陽性菌落質(zhì)粒鑒定。

圖1 表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd的構(gòu)建策略Fig.1 Construction strategy of the expression vector pYES-pgk-g6pd

1.6 g6pd基因在C.tropicalis中的過量表達(dá)

利用LiAc/ssDNA/PEG方法將重組表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd轉(zhuǎn)化至C.tropicalisCT16感受態(tài)細(xì)胞中，在添加G418的YPD平板上篩選陽性重組子。提取重組子質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物F-T7和R-CYC1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，酶切、測(cè)序鑒定重組子。C.tropicalis感受態(tài)細(xì)胞的制備及其轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[20]。

1.7 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）的酶活力檢測(cè)

取30 h的發(fā)酵液，1 100 r/min、4℃離心20 min，滅菌蒸餾水洗滌、重懸、再離心，菌體重懸于緩沖液體系：10 mmol/Lβ-巰基乙醇、2 mmol/L甘氨酸、0.071 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），并加入玻璃珠（體積比1∶1）振蕩破碎，離心取上清液（粗酶液）用于酶活力分析[13]。

反應(yīng)體系（2.56 mL）：2 mL 70 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.4 mL 35 mmol/L MgCl2、20 μL 131 mmol/L NADP+、40μL 500 mmol/L 6-磷酸-葡萄糖、0.1 mL粗酶液。30 ℃、340 nm測(cè)定NADPH吸收值變化。340 nm波長(zhǎng)處每隔30 s測(cè)定一次吸光度，反應(yīng)10 min，以吸光度y與NADPH濃度x（mmol/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。G6PDH酶活力定義：反應(yīng)體系中每分鐘還原1 μL NADP+所需的酶量為1U。

1.8 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及木糖和木糖醇的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)

將C.tropicalisCT16野生型和重組菌株C.tropicalisSYG5 以3%的接種量分別接種到木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔10 h取發(fā)酵液樣品，8 000 r/min離心4 min，HPLC檢測(cè)木糖及木糖醇濃度。HPLC（島津LC-20A）檢測(cè)條件為：色譜柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），示差折光檢測(cè)器，柱溫45 ℃，流動(dòng)相0.5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd的PCR擴(kuò)增

以C.tropicalisCT16基因組為模板，擴(kuò)增目的基因片段，電泳、測(cè)序。如圖2所示，得到的PCR產(chǎn)物單一DNA片段大小約為1.5 kb，與預(yù)期相符。將純化的PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)DNAMAN軟件和NCBI比對(duì)，與GenBank中報(bào)道的C.tropicalis基因g6pd（Accession No.XM_002548907）相似度達(dá)100%，表明g6pd基因擴(kuò)增正確。

圖2 g6pd基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene

2.2 表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd的構(gòu)建

使用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，電泳檢測(cè)如圖3所示。重組質(zhì)粒pYES-pgk-g6pd經(jīng)雙酶切得到6.0 kb和1.5 kb的清晰條帶，與預(yù)期相符，證明表達(dá)載體構(gòu)建正確。

圖3 KKppnnⅠ+XbaⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pYES-pgk-g6pd電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the plasmid pYES-pgk-g6pd double digested with KpnⅠ+ XbaⅠ

2.3 重組C.tropicalis的篩選、鑒定及酶活力分析

表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd轉(zhuǎn)入C.tropicalisCT16后，在含抗生素G418的YPD平板上進(jìn)行篩選。從平板上挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落，在含1 mg/mL G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子C.tropicalisSYG5。

提取C.tropicalisSYG5質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物F-T7和R-CYC1-Age PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從轉(zhuǎn)化子（工程菌）SYG5中擴(kuò)增g6pd基因表達(dá)盒（包括啟動(dòng)子、g6pd基因編碼序列和終止子）的特異性條帶，大小約為1.9 kb，與預(yù)期相符，且測(cè)序驗(yàn)證正確，表明重組質(zhì)粒pYES-pgk-g6pd已轉(zhuǎn)入C.tropicalisCT16。

分析30 h發(fā)酵粗酶液的G6PDH酶活力，以吸光度y與NADPH濃度x（mmol/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得方程y=0.005 5x－0.007 3（R2＝0.999 9）。C.tropicalisCT16 G6PDH的酶活力為786 U/L，C.tropicalisSYG5的G6PDH酶活力為3 145 U/L，說明g6pd基因的過量表達(dá)能顯著增強(qiáng)C.tropicalisG6PDH的活性。

圖4 重組菌株C.tropicaalis SYG5中g(shù)6pd基因表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene expression cassette from the recombinant strain C.tropicalis SYG5

2.4 野生菌和工程菌轉(zhuǎn)化木糖醇能力比較

將野生型菌C.tropicalisCT16和重組工程菌C.tropicalisSYG5分別接種于木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)液。如圖5所示，在此實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)酵液中木糖和木糖醇能較好的分離，且峰型較好，無前延、拖尾、重疊，其木糖和木糖醇的特征峰分別出現(xiàn)于11.354 min和13.161 min。

圖5 木糖和木糖醇的HPLC分析Fig.5 HPLC analysis of xylose and xylitol

如圖6所示，工程菌C.tropicalisSYG5的木糖醇生成量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，搖瓶發(fā)酵62 h時(shí)木糖醇質(zhì)量濃度達(dá)到最高值79.90 g/L，木糖醇產(chǎn)率為1.29 g/（L·h）；野生菌株CT16發(fā)酵80 h時(shí)，木糖醇生成量達(dá)到峰值，約為71.08 g/L，產(chǎn)率為0.89 g/（L·h）。與野生型菌株相比，工程菌C.tropicalisSYG5的木糖醇產(chǎn)量提高12.41%，產(chǎn)率提高44.94%。發(fā)酵62 h時(shí)，工程菌SYG5的木糖幾乎完全消耗，木糖醇呈現(xiàn)最高質(zhì)量濃度，隨后木糖醇消耗，導(dǎo)致其質(zhì)量濃度下降；野生菌C.tropicalisCT16發(fā)酵80 h時(shí)木糖醇濃度才達(dá)到最大值，但其峰值明顯低于工程菌SYG5。上述結(jié)果表明，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd的過量表達(dá)，可以顯著提高C.tropicalis的PPP途徑的G6PDH酶活力、代謝通量分配，增加NADPH供應(yīng)量，加速木糖醇合成速率和產(chǎn)量，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在木糖醇生物合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

圖6 C.tropicalis CT16與C.tropicalis SYG5搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的木糖和木糖醇質(zhì)量濃度動(dòng)態(tài)變化曲線Fig.6 Dynamic curves of xylitol production and xylose consumption in C.tropicalis CT16 and C.tropicalis SYG5 during fermentation on xylose and glucose in shaking flasks

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶g6pd基因的重組表達(dá)載體pYES-pgk-g6pd，并將其過量表達(dá)于C.tropicalisCT16，探索g6pd基因過量表達(dá)對(duì)木糖醇合成代謝影響。結(jié)果表明，發(fā)酵62 h時(shí)，攜帶重組質(zhì)粒pYES-pgk-g6pd的工程菌C.TropicalisSYG5搖瓶發(fā)酵木糖醇產(chǎn)量為79.90 g/L，與野生菌株相比，木糖醇產(chǎn)量提高12.41%，產(chǎn)率提高44.94%；g6pd基因的過量表達(dá)，增強(qiáng)了G6PDH的酶活力，提高了菌體NADPH供應(yīng)量和還原力，顯著促進(jìn)木糖醇生物合成的代謝流量分配，提高了木糖醇產(chǎn)量和木糖產(chǎn)率。因此，G6PDH是木糖醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，構(gòu)建的高產(chǎn)木糖醇工程菌為其產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化提供了重要基礎(chǔ)。

[1]EMODI A.Xylitol: its properties and food applications[J].Food Technology, 1978, 32(1): 28-32.

[2]MAKINEN K K.Xylitol and oral health[J].Advance in Food Research, 1979, 25: 137-158.

[3]PRAKASHAM R S, RAO R S, HOBBS P J.Current trends in biotechnological production of xylitol and future prospects[J].Current Trends in Biotechnology and Pharmacy, 2009, 3(1): 8-36.

[4]成英, 閆書磊, 明立雪.木糖醇的生產(chǎn)工藝及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].甘肅石油和化工, 2008, 22(3): 18-21.

[5]KO C H, CHIU P C, YANG C L, et al.Xylitol conversion by fermentation using five yeast strains and polyelectrolyte-assisted ultrafiltration[J].Biotechnology Letters, 2008, 30(1): 81-86.

[6]S NCHEZ S, BRAVO V, GARC A J F, et al.Fermentation ofD-glucose andD-xylose mixtures byCandida tropicalisNBRC 0618 for xylitol production[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(5): 709-716.

[7]IN S.Hydrolysate detoxification with activated charcoal for xylitol production byCandida guilliermondii[J].Biotechnology Letters, 2001,23(20): 1681-1684.

[8]MOREIRA DOS SANTOS M, THYGESEN G, K TTER P, et al.Aerobic physiology of redox-engineeredSaccharomyces cerevisiaestrains modified in the ammonium assimilation for increased NADPH availability[J].FEMS Yeast Research, 2003, 4(1): 59-68.

[9]KIM J H, HAN K C, KOH Y H, et al.Optimization of fed-batch fermentation for xylitol production byCandida tropicalis[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2002, 29(1): 16-19.

[10]NOLLEAU V, PREZIOSI-BELLOY L, NAVARRO J M.The reduction of xylose to xylitol byCandida guilliermondiiandCandida parapsilosis: incidence of oxygen and pH[J].Biotechnology Letters,1995, 17(4): 417-422.

[11]LEATHERS T D, DIEN B S.Xylitol production from corn fibre hydrolysates by a two-stage fermentation process[J].Process Biochemistry, 2000, 35(8): 765-769.

[12]OH Y J, LEE T H, LEE S H, et al.Dual modulation of glucose 6-phosphate metabolism to increase NADPH-dependent xylitol production in recombinantSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 47(1): 37-42.

[13]CHIN J W, KHANKAL R, MONROE C A, et al.Analysis of NADPH supply during xylitol production by engineeredEscherichia coli[J].Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102(1): 209-220.

[14]FERNANDES S, TUOHY M G, MURRAY P G.Cloning,heterologous expression, and characterization of the xylitol andL-arabitol dehydrogenase genes,TexdhandTelad, from the thermophilic fungusTalaromyces emersonii[J].Biochemical Genetics,2010, 48(5/6): 480-495.

[15]KANG H Y, KIM Y S, KIM G J, et al.Screening and characterization of flocculent yeast,Candidasp.HY200, for the production of xylitol fromD-xylose[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, 15(2): 362-367.

[16]CHOI J H, MOON K H, RYU Y W, et al.Production of xylitol in cell recycle fermentations ofCandida tropicalis[J].Biotechnology Letters,2000, 22(20): 1625-1628.

[17]KWON D H, KIM M D, LEE T H, et al.Elevation of glucose 6-phosphate dehydrogenase activity increases xylitol production in recombinantSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 43(1): 86-89.

[18]VERHO R, LONDESBOROUGH J, PENTTIL M, et al.Engineering redox cofactor regeneration for improved pentose fermentation inSaccharomyces cerevisiae[J].Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(10): 5892-5897.

[19]AHMAD I, SHIM W Y, JEON W Y, et al.Enhancement of xylitol production inCandida tropicalisby co-expression of two genes involved in pentose phosphate pathway[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2012, 35(1/2): 199-204.

[20]安伯格 D C.酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南[M].霍克克, 譯.2版.北京:科學(xué)出版社, 2009: 98-99.