楊曉春，王玉堂，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

維生素是所有生物體新陳代謝所必需的微量營(yíng)養(yǎng)因子。它們一般作為細(xì)胞內(nèi)輔酶的前體物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)重要的生化反應(yīng)。人類自身只能合成少量的維生素，所以必須從外界獲取大量的維生素（例如飲食）[1-2]。盡管大多數(shù)維生素存在于各種食物當(dāng)中，但是包括發(fā)達(dá)國(guó)家在內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)仍然存在著維生素缺乏的現(xiàn)象，這不僅僅是由于食物攝取不足，飲食不均衡也是一個(gè)非常重要的原因。常見(jiàn)的B族維生素包括硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、泛酸、生物素、葉酸和鈷胺素等。每一種B族維生素的化學(xué)性質(zhì)明顯不同，它們可以在人體內(nèi)協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)重要的新陳代謝過(guò)程，像能量的 產(chǎn)生和血紅細(xì)胞的形成等。

蔬菜和乳制品是人類B族維生素的主要來(lái)源[3]。牛乳中幾乎含有所有種類的維生素，尤其是B族維生素。研究發(fā)現(xiàn)，平均每升牛乳中葉酸含量為20～50 μg[4]，發(fā)酵乳制品，尤其是酸奶含有更多的葉酸。與蔬菜來(lái)源的B族維生素相比，乳制品和其他發(fā)酵產(chǎn)品中的B族維生素具有一定的優(yōu)勢(shì)。另外，許多發(fā)酵乳制品比原料乳中含有更高濃度的B族維生素（葉酸、核黃素等）。這就很好的解釋了一些作為乳制品起始發(fā)酵劑的菌株，例如嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌等，在從頭合成一定量的B族維生素后，能夠釋放出更多的B族維生素到培養(yǎng)基中的原因[5-7]。

乳酸乳球菌KLDS4.0325是由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“教育部乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”從中國(guó)新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離得到的1株乳酸乳球菌。經(jīng)常規(guī)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強(qiáng)的葉酸合成能力。為了在基因水平上挖掘該菌株的B族維生素合成潛力，對(duì)該菌株進(jìn)行了全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序，并利用生物信息學(xué)手段對(duì)其B族維生素合成途徑進(jìn)行了比較分析。乳酸菌代謝可以產(chǎn)生B族維生素的這一性質(zhì)不僅可以為發(fā)酵乳制品中添加一系列天然B族維生素提供了良好的方式[8]，同時(shí)也為菌株功能的挖掘提供了新的研究思路[9]。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

乳酸乳球菌KLDS4.0325來(lái)自于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）。它是從中國(guó)新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離得到的1株乳酸乳球菌。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳100g，蒸餾水1L，pH值自然。

1.2 試劑

脫脂乳 Nordmilchag公司；乙醇、異丙醇 德州康泰消毒制品有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生物技術(shù)（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司；葡萄糖、吐溫 美國(guó)Sigma公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸二氫鉀、乙酸鈉 天津市科密歐試劑公司；硫酸鎂、硫酸錳 天津市天力化學(xué)試劑公司；瓊脂粉、溶菌酶 Solabiro公司；純凈水哇哈哈集團(tuán)有限公司。

TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0，于121 ℃、20 min滅菌備用。

1.3 儀器與設(shè)備

HVE-50電熱蒸汽自動(dòng)滅菌鍋 Hirayama公司；CJ-2D超凈工作臺(tái) 天津泰斯特儀器有限公司；全系列Eppendorf移液器 德國(guó)Eppendorf公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-20G-II離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)及總DNA的提取

將冷凍干燥保藏的乳酸乳球菌KLDS4.0325以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至脫脂乳中進(jìn)行培養(yǎng)24 h[10]。再將菌株于MRS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接兩次，使菌株活力得到充分恢復(fù)。

菌株總基因組DNA的提取參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。DNA提取完成后，取2～5 L DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，以檢測(cè)提取DNA的完整性和質(zhì)量。最后，送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定。

1.4.2 基因組的測(cè)序、組裝及注釋

乳酸乳球菌KLDS4.0325經(jīng)全基因組鳥(niǎo)槍法進(jìn)行測(cè)序后，利用SOAOdono軟件進(jìn)行序列拼接。所有的操作都按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行操作[11-15]。利用GeneMark和Glimmer軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)[16-17]。將獲得的全基因組序列利用BLAST[18-19]工具掃描相應(yīng)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（例如非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)和全球通用蛋白數(shù)據(jù)等）進(jìn)行序列的注釋。乳酸乳球菌KLDS4.0325的全基因組序列已經(jīng)上傳到了GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為：CP006766。

1.4.3 生物信息學(xué)分析

利用ORFfinder預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框[20]。維生素的一般合成途徑是從京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的。從Uniport蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了B族維生素合成途徑的蛋白序列后，在Linux操作系統(tǒng)內(nèi)針對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325全基因組序列建庫(kù)，使用BLASTp本地比對(duì)程序?qū)⑦@些獲得的蛋白序列針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)搜索[21]。9株參考菌株在B族維生素合成途徑中涉及的酶的序列信息是從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的。這些菌株包括Lactococcus lactissubsp.lactisIL1403（縮寫(xiě)LLA，登錄號(hào)AE005176）、Lactococcus lactissubsp.lactisKF147（LLK，CP001834）、Lactococcus lactissubsp.lactisCV56 （LLT，CP002365）、Lactococcus lactissubsp.lactisIO-1 （LLS，AP012281）、Lactococcus lactissubsp.cremorisSK11 （LLC，CP000425）、Lactococcus lactissubsp.cremorisMG1363（LLM，AM406671）、Lactococcus lactissubsp.cremorisA76（LLR，CP003132）、Lactococcus lactissubsp.cremorisNZ9000（LLN，CP002094）、Lactococcus lactissubsp.cremorisUC509.9（LLI，CP003157）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸乳球菌KLDS 4.0325的葉酸（VB11）生物合成途徑分析

有兩條關(guān)于葉酸合成的途徑。其中，第一條合成途徑由嘌呤代謝（purine metabolism）途徑中所產(chǎn)生的GTP，即鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸作為整個(gè)合成途徑的最初底物，經(jīng)一系列酶的催化形成葉酸；第二條途徑是由苯基丙氨酸合成（phenylalanine biosynthesis）途徑中形成的分支酸（chorismate）也可以進(jìn)入葉酸合成途徑葉酸。

乳酸乳球菌的葉酸生物合成途徑中涉及的酶在各乳酸乳球菌中的分布如表1所示。在第一條葉酸合成途徑中，KLDS4.0325、LLA、LLC和LLM 4株乳酸乳球菌除了不含[EC3.6.1.-]編碼基因外，它們的基因組中包含有整個(gè)合成途徑中其他酶類的編碼基因。因此，這4株菌在發(fā)酵過(guò)程中可正常產(chǎn)生葉酸。而其他6株菌株因不含關(guān)鍵性GTP環(huán)化水解酶Ⅰ[EC3.5.4.16]，同時(shí)也不含另一途徑中的關(guān)鍵性酶[EC3.6.1.-]和堿性磷酸酶[EC3.1.3.1]，因而不能通過(guò)該途徑產(chǎn)生葉酸。在該途徑中，KLDS4.0325和LLM的基因組中編碼的整個(gè)葉酸合成途徑的所涉及的酶的編碼基因拷貝數(shù)完全相同，特別是堿性磷酸酶的編碼基因拷貝數(shù)都為2，而菌株LLA和LLC所涉及的酶的編碼基因均為單拷貝基因。另外，KLDS4.0325和LLM的基因組中都同時(shí)編碼了二氫葉酸合成酶（dihydrofolate synthase）和葉酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase），而菌株LLA和LLC基因組中只編碼了葉酸多聚谷氨酸合成酶。因此，在第一條葉酸合成途徑中，KLDS4.0325和LLM在基因水平上表現(xiàn)出了較強(qiáng)的合成能力。

表1 葉酸生物合成途徑中涉及的酶在10株乳酸乳球菌基因組中的分布Table 1 Distribution of enzymes involved in folate biosynthetic pathway in the genomes of 10Lactococcus laccttiiss

此外，乳酸乳球菌KLDS4.0325和9株參考菌株還可以通過(guò)苯基丙氨酸合成途徑中形成的分支酸（chorismate）進(jìn)入葉酸合成途徑生成葉酸。由表1可知，包括KLDS4.0325在內(nèi)的10株乳酸乳球菌都含有該途徑的完整編碼基因。因此，這10株菌株都可以由該途徑產(chǎn)生葉酸。但是，各菌株基因組中相關(guān)酶的編碼基因的分布情況存在一定差異。例如，關(guān)于能夠催化分支酸形成4-氨基-4-脫氧分支酸的帕拉-對(duì)氨基苯甲酸甲酯合成酶的編碼基因，菌株KLDS4.0325、LLK、LLT、LLS、LLR以及LLN的基因組中該酶的編碼基因拷貝數(shù)均為2，而其他菌株都為1。此外，關(guān)于二氫葉酸合成酶（ihydrofolate synthase）和葉酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase）的基因在各菌株基因組中的存在情況的差異也比較大，其中KLDS4.0325、LLK、LLM、LLR、LLN以及LLI的基因組中同時(shí)編碼這兩種基因，其他菌株只編碼了葉酸多聚谷氨酸合成酶基因。

2.2 乳酸乳球菌KLDS4.0325的核黃素生物合成途徑分析

在核黃素（riboflavin）代謝通路中有兩條核黃素的合成支路：第一條支路是來(lái)自于嘌呤代謝（purine metabolism）途徑產(chǎn)生的鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸腺苷（guanosine 5’-triphosphate，GTP）經(jīng)過(guò)一系列酶的催化產(chǎn)生核黃素；另一條支路是由磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）產(chǎn)生的D-核酮糖5-磷酸經(jīng)一系列酶催化產(chǎn)生核黃素。

表2 核黃素合成途徑中相關(guān)酶在10株乳酸乳球菌中的分布Table 2 Distribusion of enzymes involved in riboflavin biosynthetic pathway in the genomes of 10Lactococcus laccttiiss

由表2可知，10株菌株都不含有第一條支路中的關(guān)鍵酶的編碼基因[EC3.1.3.-]。因此，10株菌株全都不能通過(guò)該支路完成核黃素的合成。在另一條核黃素合成支路中，10株菌的基因組中都含有編碼該途徑上的所有相關(guān)酶類的基因，且編碼酶的基因個(gè)數(shù)完全相同，均為單拷貝基因。因此，10株菌都可以通過(guò)該途徑進(jìn)行VB2的生物合成，并且在基因水平上，乳酸乳球菌KLDS4.0325的核黃素合成能力與這9株菌相比無(wú)明顯差異。

2.3 乳酸乳球菌KLDS4.0325的其他B族維生素合成途徑分析

表3 乳酸乳球菌KLDS4.0325在VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB12的生物合成途徑中缺失的關(guān)鍵酶Table 3 The key enzymes absent from biosynthetic pathways for VB1V,B3V,B5V,B6V,B7 andd VB1122 iinn L.lactiiss KLDS4..00332255

應(yīng)用同樣的方法對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325進(jìn)行其他常見(jiàn)B族維生素的代謝途徑分析。如表3所示，該菌株基因組中缺乏編碼VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB12等生物合成途徑關(guān)鍵酶的基因，因此不具備合成這些B族維生素的潛力。

3 結(jié) 論

對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325的B族維生素生物合成途徑進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明，該菌株基因組中編碼了較為完整的葉酸和核黃素合成途徑的基因。與其他9株參考菌株相比，乳酸乳球菌KLDS4.0325在基因水平上表現(xiàn)出了較強(qiáng)的葉酸合成潛力，而核黃素合成能力與參考菌株差別不大。由于該菌株基因組中缺乏編碼其他B族維生素合成的關(guān)鍵性酶基因。因此，在基因水平上表現(xiàn)出不能合成其他B族維生素的能力。葉酸是人類膳食中所必需的化合物，但是葉酸在個(gè)別群體中甚至較為發(fā)達(dá)國(guó)家的人群中是缺乏的，人體中缺乏葉酸可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷病，冠心病和某些癌癥的發(fā)生。因而，獲得一系列具有高產(chǎn)葉酸能力的發(fā)酵劑是十分必要的。目前，基因工程技術(shù)發(fā)展速度較快，在后續(xù)的研究中，可以嘗試應(yīng)用基因工程的方法對(duì)該菌株的某些葉酸合成基因進(jìn)行過(guò)度表達(dá)以獲取更多的葉酸。

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