江雨璐，王中新，沈繼錄

◇經(jīng)驗與體會◇

熱帶念珠菌對氟康唑耐藥機制的初步研究

江雨璐，王中新，沈繼錄

25株臨床分離的熱帶念珠菌通過ATB FUNGUS 3試條分類為對氟康唑（FCA）敏感的菌株和耐藥的菌株，使用ABI 7300熒光定量分析儀擴增外排基因CDR1、MDR1和靶酶基因ERG11，用2－ΔΔCT法計算相對表達量，應(yīng)用Fisher確切概率法統(tǒng)計分析敏感菌株和耐藥菌株的高表達率。結(jié)果顯示MDR1和ERG11基因的高表達率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CDR1基因的高表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。熱帶念珠菌對FCA耐藥與外排基因MDR1和靶酶基因ERG11的高表達相關(guān)。

熱帶念珠菌；氟康唑耐藥；CDR1；MDR1；ERG11

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等的廣泛使用，醫(yī)源侵入性操作的增多，念珠菌感染率日益升高，雖然白色念珠菌仍然是念珠菌感染的主要病原菌，但近些年來，非白色念珠菌比例增多，熱帶念珠菌已被認定為最流行的非白色念珠菌［1］。由于唑類藥物特別是氟康唑（fluconazole，F(xiàn)CA）的廣泛應(yīng)用，耐藥性日益突出。念珠菌對唑類藥物的耐藥機制主要有藥物靶酶的變化和外排泵基因的過度表達2種［2］。唑類藥物的靶酶是ERG11基因編碼的羊毛甾醇14 α-去甲基化酶，CDR1基因和MDR1基因編碼的CDR1p和MDR1p是念珠菌最重要的2類藥物外排蛋白。該實驗采用實時熒光定量PCR法檢測熱帶念珠菌CDR1、MDR1、ERG11基因的表達情況并比較耐藥菌株和敏感菌株的表達差異，并探討其耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 收集2010年1月～2012年12月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科分離的熱帶念珠菌25株，均經(jīng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基和法國生物梅里埃公司ATB Expression儀鑒定。質(zhì)控菌株為熱帶念珠菌標準菌株ATCC 750。

1.1.2 試劑與設(shè)備 ATB ID 32C酵母菌鑒定試劑盒、ATB FUNGUS 3酵母菌藥敏試劑盒（微量稀釋法）、ATB Expression儀均購自法國生物梅里埃公司；柱式酵母總RNA抽提純化試劑盒購自上海生工生物公司；Thermo nanodrop濃度儀購自美國Thermo Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；熒光定量試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；ABI 7300熒光定量分析儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.1.3 引物 根據(jù)GenBank序列，委托寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計、合成外排基因CDR1和MDR1熒光定量引物，委托上海生工生物公司合成靶酶基因ERG11引物，其引物序列參考文獻［3］，委托寶生物工程（大連）有限公司合成內(nèi)參基因ACT1引物，其引物序列參考文獻［4］，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 藥敏實驗 采用法國生物梅里埃公司的ATB FUNGUS 3試條，抗真菌藥物包括5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）、兩性霉素B（amphotericin B，AMB）、FCA、伊曲康唑（itraconazole，ITR）、伏立康唑（voriconazole，VRC）。按照說明書進行操作，以最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）≤8 mg/L為敏感，以MIC≥64 mg/L為耐藥，分選出敏感菌株和耐藥菌株。質(zhì)控菌株按照說明書說明選擇近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2.2 總RNA提取及cDNA的合成 挑取科瑪嘉念珠菌顯色板培養(yǎng)的單個菌落接種于3 ml YPD液體培養(yǎng)基上，37℃250 r/min振蕩培養(yǎng)24h，使菌處于對數(shù)生長期。使用柱式酵母總RNA抽提純化試劑盒抽提總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，用Thermo nanoprop濃度儀測定RNA的濃度與純度，A260/A280＝1.8～2.0才可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，放入－80℃保存。

1.2.3 實時熒光定量PCR 以50 μl反應(yīng)體系進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系包括25 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×），10 μmol/L的上下游引物各2 μl，ROX Reference Dye（50×）1 μl，無酶水16 μl，4 μl 1∶10稀釋的cDNA模板。反應(yīng)條件為95℃30 s預(yù)變性后，95℃5 s，60℃31 s，共40個循環(huán)，擴增完畢后進行熔解曲線分析。每個菌株有2個復孔，同時設(shè)無模板對照。

1.3 統(tǒng)計學處理運用2－ΔΔCT法，計算出耐藥菌株和敏感菌株目的基因相對于參照菌株的目的基因的表達倍數(shù)，即相對表達量，其中ΔΔCT＝ΔCT（實驗菌株）－ΔCT（參照菌株），ΔCT＝CT（目的基因）－CT（內(nèi)參基因ACT1）。統(tǒng)計基因高表達菌株在耐藥組與敏感組所占的比例，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，耐藥組與敏感組應(yīng)用Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 藥敏實驗選擇25株熱帶念珠菌17株對FCA敏感（MIC≤8 mg/L），8株對FCA耐藥（MIC≥64 mg/L），此8株耐FCA菌株對ITR和VRC存在交叉耐藥現(xiàn)象。

2.2 CDR1、MDR1和ERG11 mRNA表達水平從熔解曲線中可以看出，每個基因在熔解溫度Tm處只存在一個峰，說明樣本的目的基因都獲得了特異性擴增。見圖1、2。根據(jù)文獻［3］，相對表達量≥2.5為高表達，8株耐藥株中有4株不止1種基因高表達，有1株3種基因均不高表達?，F(xiàn)統(tǒng)計基因高表達菌株在敏感組和耐藥組所占百分率，見圖3。在敏感組中有1株CDR1的高表達，所占比例5.88%，耐藥組有2株CDR1的高表達，所占比例為25%；在敏感組中沒有MDR1的高表達，耐藥組有6株MDR1的高表達，所占比例75%；在敏感組中有1株ERG11的高表達，所占比例為5.88%，耐藥組有4株ERG11的高表達，所占比例50%。利用Fisher確切概率法顯示敏感組和耐藥組CDR1的高表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），耐藥組MDR1和ERG11的高表達率顯著高于敏感組的高表達率（P＜0.05）。

圖1 ACT1、CDR1和MDR1基因的熔解曲線

圖2 ERG11基因的熔解曲線

圖3 基因高表達菌株在敏感組和耐藥組中百分率

3 討論

近年來，以熱帶念珠菌為代表的非白色念珠菌日益增多，美國的一項有關(guān)侵襲性真菌病的調(diào)查［5］顯示，熱帶念珠菌的臨床分離率在1997年～2003年從4.6%上升到7.5%，以FCA為代表的唑類藥物耐藥問題也日益嚴重，引起臨床的廣泛關(guān)注，但國內(nèi)外對熱帶念珠菌耐藥機制的研究并不多，本文針對熱帶念珠菌的主要耐藥基因CDR1、MDR1和ERG11在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況進行研究。

本實驗采用實時熒光定量技術(shù)，應(yīng)用2－ΔΔCT法檢測臨床分離的非配對的熱帶念珠菌CDR1、MDR1和ERG11基因的相對表達水平，本實驗對耐藥組和敏感組的高表達率進行分析而不是對其相對表達量直接進行分析，考慮到這些菌株不是來自于同一個患者，具有異質(zhì)性，分析高表達率更能反映這些基因的表達與耐藥的關(guān)系。結(jié)果顯示耐藥組MDR1和ERG11基因的高表達率顯著高于敏感組的高表達率，而耐藥組CDR1基因的高表達率與敏感組的高表達率差異無統(tǒng)計學意義，這說明熱帶念珠菌臨床分離株的耐藥性與主要易化載體超家族蛋白和羊毛甾醇14 α-去甲基化酶的高表達相關(guān)，前者與張月香等［6］研究結(jié)論相符，后者與Jiang et al［3］和Vandeputte et al［7］研究結(jié)論相符。主要易化載體超家族蛋白利用離子梯度勢能作為能量來源，將細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運到細胞外，導致耐藥；羊毛甾醇14 α-去甲基化酶作為靶酶，表達增高意味著需要更高的胞內(nèi)藥物濃度來抑制靶酶的活力，同樣導致了耐藥。江岑等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)熱帶念珠菌耐藥株中主動外排蛋白的底物羅丹明6G的外排作用不顯著，這與本實驗中耐藥組CDR1的高表達率與敏感組的高表達率差異無統(tǒng)計學意義相符。

本研究顯示耐藥菌株存在交叉耐藥現(xiàn)象，由于Sanglard et al［9］將過度表達的MDR1基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母pdr5突變株，發(fā)現(xiàn)其只對FCA耐藥，而對其他唑類藥物不耐藥，MDR1p底物具有特異性，因此交叉耐藥現(xiàn)象可能是由于靶酶基因ERG11的高表達引起，而不是由MDR1基因的高表達造成。本實驗中有1株敏感株CDR1基因的高表達和1株敏感株ERG11基因的高表達，說明主動外排蛋白的高表達和靶酶的高表達不一定導致耐藥。實驗中8株耐藥株中有4株都不止一種耐藥基因的高表達，說明熱帶念珠菌的耐藥可能是由多種基因共同作用的結(jié)果，這對研發(fā)新的抗真菌藥物具有理論意義。實驗中有一株耐藥株3種基因均不高表達，說明此熱帶念珠菌存在其他的耐藥機制。

熱帶念珠菌感染率和耐藥率的升高給臨床抗真菌治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，本實驗中對熱帶念珠菌外排蛋白和靶酶的研究對研發(fā)新的抗真菌藥物具有重要意義，但熱帶念珠菌對FCA的耐藥有多種耐藥機制，過程復雜，需要不斷深入和持續(xù)的研究。

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［2］ 顧 遲，陳功祥，周宏偉.念珠菌對唑類藥物耐藥性及耐藥機制的研究進展［J］.臨床藥物治療雜志，2010，8（3）：44－8.

［3］ Jiang C，Dong D F，Yu B Q，et al.Mechanisms of azole resistance in 52 clinical isolates of Candida tropicalis in China［J］.J Antimicrob Chemother，2013，68（4）：778－85.

［4］ Silva S，Hooper S J，Henriques M，et al.The role of secreted aspartyl proteinases in Candida tropicalis invasion and damage of oral mucosa［J］.Clin Microbiol Infect，2011，17（2）：264－72.

［5］ Pfaller M A，Diekema D J.Epidemiology of invasive candidiasis：a persistent publichealth problem［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20（1）：133－63.

［6］ 張月香，楊淑華，王建紅.熱帶念珠菌耐藥基因的初步研究［J］.中國醫(yī)學檢驗雜志，2009，10（3）：122－3.

［7］ Vandeputte P，Larcher G，Bergès T，et al.Mechanisms of azole resistance in a clinical isolate of Candida tropicalis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49（11）：4608－15.

［8］ 江 岑，董丹鳳，俞焙秦，等.3種念珠菌對氟康唑耐藥的易感性及耐藥機制比較［J］.中國感染與化療雜志，2013，13（4）：296－301.

［9］ Sanglard D，Ischer F，Koymans L，et al.Amino acid substitutions the cytochrome P-450 lanosterol 14α-demethylase（CYP5lA1）from azole resistant Candida albicans clinical isolates contribute to resistance to azole antifungal agents［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42（2）：241－53.

A preliminary study on fluconazole resistance mechanism of Candida tropicalis

Jiang Yulu，Wang Zhongxin，Shen Jilu
（Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Fluconazole（FCA）-susceptible and resistant isolates were classified by ATB FUNGUS 3 strip from 25clinical Candida tropicalis，efflux gene CDR1，MDR1 and enzyme gene ERG11 were amplified by ABI 7300 Taq-Man analyzer，relative expression quantities were calculated by 2－ΔΔCTmethod，overexpression rates of sensitive isolates and resistant isolates were statistically analyzed using Fisher exact probability method.There were statistically significant differences in the overexpression rates of MDR1 and ERG11（P＜0.05），no statistically significant difference in the overexpression rate of CDR1（P＞0.05）.Candida tropicalis resistance to FCA was mediated by overexpression of efflux gene MDR1 and enzyme gene ERG11.

Candida tropicalis；fluconazole resistance；CDR1；MDR1；ERG11

R 379.4

A

1000－1492（2014）04－0536－04

2013－12－05接收

安徽省教育廳基金（編號：KJ2008B299）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022

江雨璐，女，碩士研究生；王中新，男，主任技師，碩士生導師，責任作者，E-mail：aywzhx87＠163.com