解傳斌，顏雨春

Livin與Caspase-3在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

解傳斌，顏雨春

目的探討凋亡抑制蛋白（IAP）Livin和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）在口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）中的表達(dá)及其相關(guān)性，為對(duì)患者診斷及監(jiān)測(cè)、評(píng)估術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)程度提供參考。方法采用RT-PCR法對(duì)45例OSCC組織及11例正常口腔組織（NOT）中的Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在45例OSCC組織及11例NOT組織均有不同程度的表達(dá)；Livin mRNA在OSCC組織中的表達(dá)高于NOT組織（P＜0.05），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩者在OSCC組織中的相對(duì)含量均與患者的性別和年齡無(wú)關(guān)，但與腫瘤的病理分期、分化程度有關(guān)，相關(guān)分析顯示Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)呈相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論Livin與Caspase-3基因的異常表達(dá)與OSCC的病理生物學(xué)行為密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Livin與Caspase-3可為評(píng)價(jià)OSCC的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后提供臨床參考，為研究OSCC發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

口腔鱗狀細(xì)胞癌；凋亡抑制蛋白Livin；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；RT-PCR

在頭頸部惡性腫瘤中，口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）較常見(jiàn)，因其惡性程度較高，且具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)性，易發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害患者的生命安全。我國(guó)口腔頜面部的惡性腫瘤80%以上為鱗狀細(xì)胞癌，5年生存率約為60%，且發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)［1］。目前針對(duì)OSCC 的研究較多集中于細(xì)胞凋亡和增殖的平衡機(jī)制方面，已證實(shí)凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）Livin及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）在上述過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在乳腺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、腦星形細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)Livin的表達(dá)［2－5］；Caspase-3作為半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而拮抗或抑制Caspase-3的活性可抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生［6］。但二者在OSCC及正?？谇唤M織（NOT）中表達(dá)情況則少有報(bào)道，該實(shí)驗(yàn)采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)分析OSCC及NOT中Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達(dá)程度，探討兩者在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源選取2011年10月～2013年2月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科就診，并均經(jīng)組織病理檢查確診為OSCC患者新鮮組織標(biāo)本45例，另選11例患者為陰性對(duì)照組（NOT組）。所有OSCC組患者均為首次確診，術(shù)前均未行放、化療或其他抗腫瘤治療，均無(wú)遠(yuǎn)端臟器的轉(zhuǎn)移，無(wú)其他惡性腫瘤史，無(wú)家族腫瘤史。所有切取的45例OSCC組織中男28例，女17例；年齡43～79（43.21± 16.73）歲；依國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）（2002）口腔癌TNM分類(lèi)分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期15例；參照1997年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：高分化29例，中低分化16例；伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例。另11例NOT組織標(biāo)本中7例取自阻生齒拔除患者，4例取自牙槽嵴修整患者。所有標(biāo)本均于術(shù)中取材后立即置于液氮中，然后移至－80℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器PCR試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑、DNA Marker、Taq DNA聚合酶（Fermentas公司，美國(guó)）；TGL-16H冷凍離心機(jī)（黑馬儀器公司，中國(guó)）；瓊脂糖凝膠（OXOID公司，英國(guó)）；TGL-18R冷凍離心機(jī)、DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠(chǎng)）；溴化已錠（10 mg/ml）（Sigma公司，美國(guó)）；2720PCR儀器（ABI公司，美國(guó)）；GSM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（3.0）（美國(guó)SIM公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法Livin與Caspase-3及內(nèi)參β-action引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成引物，見(jiàn)表1。取備用組織100 mg按TRIzol法提取總RNA，用MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR：以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 L作為模板，選用PCR擴(kuò)增試劑在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。在PCR儀中，Livin的擴(kuò)增條件為：94℃45 s，退火53℃45 s，延伸72℃45 s，冰上冷卻，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；Caspase-3的擴(kuò)增條件：94℃45 s，退火55℃45 s，延伸72℃45 s，冰上冷卻，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；內(nèi)參β-actin的PCR擴(kuò)增條件為：94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃30 s，冰上冷卻，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取適量PCR反應(yīng)產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色。用數(shù)字化凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，半定量分析電泳條帶的灰度值。結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值的比值表示。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

表1 Livin、Caspase-3及內(nèi)參β-actin引物序列和片段長(zhǎng)度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)差異，兩種指標(biāo)之間的表達(dá)相關(guān)性采用Pearson列聯(lián)系數(shù)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的在OSCC和NOT組織中的表達(dá)Livin mRNA與Caspase-3 mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果提示Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在NOT組織中均少量表達(dá)，但在OSCC中，Livin mRNA的表達(dá)量高于Caspase-3 mRNA，見(jiàn)圖1。Caspase-3 mRNA在OSCC與NOT組織中的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Livin mRNA在OSCC中的表達(dá)量（0.542± 0.074）高于NOT組織（0.181±0.026），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC及NOT組織中的表達(dá)率，見(jiàn)表3。

圖1 RT-PCR檢測(cè)Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達(dá)

表2 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC和NOT組織中的相對(duì)含量（±s）

表2 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC和NOT組織中的相對(duì)含量（±s）

與NOT組比較：▲▲P＜0.01

組別n Livin mRNACaspase-3 mRNA OSCC450.542±0.074▲▲0.102±0.025 NOT110.181±0.0260.193±0.031

表3 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC及NOT組織中的表達(dá)率［n（%）］

2.2 Livin mRNA、Caspase-3 mRNA表達(dá)與OSCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Livin mRNA在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化、Ⅲ～Ⅳ期的OSCC組織中的表達(dá)高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、高分化、Ⅰ～Ⅱ期的OSCC組織（P＜0.01）。Caspase-3 mRNA在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化、Ⅲ～Ⅳ期的OSCC組織中的表達(dá)低于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、高分化、Ⅰ～Ⅱ期的OSCC組織（P＜0.05）。Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達(dá)在OSCC患者年齡、性別參數(shù)方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明Livin mRNA在OSCC組織中的相對(duì)含量，隨著OSCC組織分化的增高而增高，亦隨著組織學(xué)分級(jí)的增高而增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，見(jiàn)表4。

表4 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系（±s）

表4 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系（±s）

項(xiàng)目nLivin mRNAt值P值Caspase-3 mRNAt值P值性別0.8720.388－0.1620.872男280.533±0.0800.101±0.023女170.555±0.0710.103±0.030年齡（歲）0.6820.278－0.1540.864＜54160.539±0.0610.099±0.019≥54290.543±0.0820.104±0.026分期－11.843＜0.0012.8390.007Ⅰ～Ⅱ300.395±0.0510.113±0.024Ⅲ～Ⅳ150.836±0.0820.081±0.028淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移－10.209＜0.0013.2340.004無(wú)270.412±0.0650.115±0.025有180.737±0.0690.084±0.027分化程度－12.014＜0.0013.0050.001高分化290.399±0.0710.116±0.021中低分化160.801±0.0640.076±0.030

表5 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC中表達(dá)的相關(guān)性

2.3 Livin mRNA、Caspase-3 mRNA在OSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性在45例OSCC組織中，僅測(cè)得2例Livin mRNA與Caspase-3 mRNA同時(shí)表達(dá)，未測(cè)得兩基因同時(shí)不表達(dá)的組織。僅Caspase-3 mRNA表達(dá)者12例，僅Livin mRNA表達(dá)者31例。根據(jù)Pearson列聯(lián)系數(shù)相關(guān)分析，Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)呈相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表5。

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的生理性死亡過(guò)程，它是受基因控制的，不但需要許多與免疫相關(guān)的凋亡信號(hào)介導(dǎo)，還需要凋亡誘導(dǎo)劑和抑制劑的參與來(lái)共同完成細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，Caspase-3被激活后能水解大量蛋白底物，激活其他種類(lèi)的Caspase，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］，說(shuō)明Caspases-3對(duì)細(xì)胞凋亡是必需的。Caspase-3在OSCC組織中明顯降低，提示Caspase-3活化減少，不能引起足夠的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞異常增殖，引發(fā)癌變［8］。

Livin作為凋亡抑制基因，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族（IAPs）中的新成員。目前發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)IAP家族成員共有8個(gè)，其共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是N端有一個(gè)或多個(gè)（目前最多為3個(gè)）串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列，C端含有或不含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)［9］。Livin抑制細(xì)胞凋亡作用主要是通過(guò)其BIR區(qū)與Caspases家族結(jié)合，抑制其活性，尤其是抑制Caspases-3/-7和Caspases-9的活性，阻止Caspase蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)的正常功能［10］。因此，細(xì)胞凋亡途徑失去重要的酶，使凋亡酶依賴(lài)的細(xì)胞凋亡無(wú)法正常進(jìn)行。

本研究結(jié)果提示，在OSCC組織中，Caspase-3 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于NOT組織，其相對(duì)含量也低于NOT組織，且隨著臨床分期的增加、腫瘤分化程度的降低，其相對(duì)含量也相應(yīng)降低，而與年齡、性別因素?zé)o關(guān)。在NOT組織中，Caspase-3 mRNA的相對(duì)含量和表達(dá)率都比較高；而在OSCC組織中，Caspase-3 mRNA的表達(dá)較低。這與毛麗梅等［11］報(bào)道相似。提示Caspase-3可能在OSCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制中起抑制作用。

Schmollinger et al［12］研究發(fā)現(xiàn)Livin的表達(dá)缺失可使腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃避，提示Livin或可作為腫瘤免疫治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。陶菲克等［13］研究發(fā)現(xiàn)皮膚鱗癌組織中Livin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為72.2%，提示Livin基因在皮膚鱗癌發(fā)生、發(fā)展中起作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Livin在OSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于NOT組織，并且其表達(dá)與OSCC的病理分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Livin可能在OSCC的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起重要作用，這與吳文新等［14］在大腸管狀腺瘤癌變中的研究一致，劉俊華等［15］在非小細(xì)胞肺癌中的研究也得出了類(lèi)似的結(jié)論。

本研究表明，Livin mRNA在NOT中低表達(dá)或表達(dá)缺失，而在OSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率和相對(duì)含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)顯示Livin mRNA在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的OSCC組織中，Livin mRNA的相對(duì)含量也高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，并且在OSCC組織中的相對(duì)含量與病理分化程度、臨床分期呈正相關(guān)，而與年齡、性別因素?zé)o關(guān)。提示Livin可能參與促進(jìn)了OSCC的發(fā)生、發(fā)展，其或可作為評(píng)價(jià)OSCC臨床分期，評(píng)估其惡性程度及預(yù)后的一個(gè)有用指標(biāo)，說(shuō)明Livin在OSCC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)呈相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Livin與Caspase-3在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中可能存在相互抑制的作用。Caspase-3編碼的蛋白表達(dá)降低，從而減弱了其對(duì)Livin的抑制作用，而Livin表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，過(guò)多的細(xì)胞凋亡抑制，引起細(xì)胞周期調(diào)控異常，使口腔黏膜上皮過(guò)度增生，在各種理化因素作用下最終發(fā)生癌變。本研究提示聯(lián)合檢測(cè)Livin與Caspase-3可以為OSCC臨床分級(jí)、分期、評(píng)估預(yù)后提供數(shù)據(jù)支持，但仍需大量的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。

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Expression and relativity of Livin and Caspase-3 inhuman oral squamous cell carcinoma

Xie Chuanbin，Yan Yuchun
（Dept of Stomatology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the expression and relativity of Livin and Caspase-3 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsThe expression of Livin mRNA and Caspase-3 mRNA in 45 cases of OSCC and 11 cases of normal oral tissue were detected by reverse RT-PCR.ResultsThe positive expression rates of Livin mRNA in OSCC were significantlyhigher than those in normal oral tissue（P＜0.05）.Compared with those without lymph node metastasis in OSCC，the positive ratios of Livin mRNA with lymph node metastasis were significantlyhigher（P＜0.05）.The expressions of Livin were significantly related with pathological stage and the lymph node metastasis，but neither of them was correlated with sex and age.Correlation analysis showed that Livin expression level was related to Caspase-3 level（P＜0.01）.ConclusionThe abnormal expressions of Livin and Caspase-3 are closely related to the occurrence，progress and metastasis of OSCC，which can evaluate the degree of malignancy and prognosis of patients with OSCC reference.

oral squamous cell carinoma；inhibitor of apoptosis protein Livin；Caspase-3；RT-PCR

R 739.8

A

1000－1492（2014）04－0498－04

2013－12－05接收

安徽省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：2010-B-15）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，合肥 230022

解傳斌，男，碩士研究生；顏雨春，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：99yyc＠sina.cn