薛永舉，梅 俏，丁 浩，胡 靜，劉曉昌，許建明，胡乃中

潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中MMP-2、MMP-9與腸黏膜通透性關(guān)系的臨床研究

薛永舉1，2，梅 俏1，丁 浩1，胡 靜1，劉曉昌1，許建明1，胡乃中1

目的探討潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9水平與腸黏膜通透性的臨床關(guān)聯(lián)，為UC的發(fā)病機(jī)制及治療提供可靠的參考指標(biāo)。方法采用ELISA法檢測(cè)38例UC患者（UC組）和30例正常對(duì)照者（正常對(duì)照組）外周血中MMP-2、MMP-9水平；采用高效液相色譜示差法檢測(cè)UC組和正常對(duì)照組口服乳果糖（L）和甘露醇（M）測(cè)試液后尿液中L、M含量，計(jì)算L/M比值。結(jié)果UC組外周血中MMP-2、MMP-9水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。UC組外周血中MMP-2、MMP-9水平與UC疾病嚴(yán)重程度及病變范圍呈一定相關(guān)性；UC組患者尿中L/M比值顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與腸黏膜通透性改變有良好的相關(guān)性。結(jié)論活動(dòng)期UC患者腸黏膜通透性增高，可能與外周血中MMP-2、MMP-9水平增高有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；腸黏膜通透性；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，近年有研究［1］顯示UC患者多存在不同程度的腸黏膜通透性增高的現(xiàn)象。且有研究［2］表明，腸黏膜通透性的改變可發(fā)生在腸道出現(xiàn)明顯的炎性改變之前。UC的主要病理?yè)p傷涉及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的更新及結(jié)締組織的重建。ECM是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場(chǎng)所，其成分的降解與合成處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，如平衡紊亂將導(dǎo)致器官的各種病理改變，如潰瘍形成或器官纖維化［3－4］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）裂解ECM成分，可通過(guò)降解內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接引起血管內(nèi)皮通透性增加，參與結(jié)腸黏膜損傷和并與結(jié)腸組織修復(fù)有關(guān)［5］。該研究通過(guò)檢測(cè)UC患者外周血中MMP-2及MMP-9水平，并與UC患者的腸黏膜通透性及主要臨床特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為UC的發(fā)病機(jī)制及治療提供可靠的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2010年7月～2012年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷為活動(dòng)性UC患者38例（UC組），男20例，女18例，年齡21～70（34.7±10.3）歲，其診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2007年《對(duì)我國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》［6］，排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①排除其他自身免疫性疾??；②排除感染性結(jié)腸炎：痢疾桿菌感染，沙門(mén)氏菌感染、阿米巴感染、血吸蟲(chóng)感染及腸結(jié)核等；③排除克羅恩病、大腸癌、肝炎等；④排除真菌性腸炎、出血壞死性腸炎、過(guò)敏性紫癜、膠原性結(jié)腸炎、結(jié)腸憩室、HIV感染合并的結(jié)腸炎等。正常對(duì)照組30例，其中男16例，女14例，年齡24～59（37.6±8.9）歲。各組間在年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 主要試劑人MMP-2、MMP-9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D公司；乳果糖及甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)天地公司產(chǎn)品；乳果糖口服液：荷蘭蘇威公司；20%甘露醇溶液：安徽雙鶴藥業(yè)股份有限公司。

1.3 主要儀器酶標(biāo)儀RS-232：瑞士公司；Agilentl100系列高效液相色譜儀系列配置G1362A示差檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品）；SB3200超聲波清洗器（上海必能信超生有限公司產(chǎn)品）；Agilent色譜數(shù)據(jù)工作站：美國(guó)Agilent公司軟件（2001-2008）。

1.4 方法

1.4.1 ELISA法檢測(cè)MMP-2、MMP-9水平 研究對(duì)象均于清晨空腹平靜狀態(tài)下抽取5 ml肘靜脈血，按試劑盒說(shuō)明書(shū)采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血漿MMP-2、MMP-9的水平。

1.4.2 尿液標(biāo)本收集 所有測(cè)試者前1 d晚上22時(shí)起禁食水，次日清晨空腹排空尿液后，口服L和M測(cè)試液各50 ml，此后禁水30 min、禁食2h，收集口服L和M后6h內(nèi)全部尿液，取其中20 ml滴入2%硫柳汞2～4滴作防腐處理后，置－20℃保存待測(cè)［7］，后將冰凍貯存樣品常溫溶化、搖勻、離心10 min，以去除沉淀物后加入相應(yīng)試劑后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 尿液中L和M濃度測(cè)定方法 采用HPLC示差法檢測(cè)尿液中L和M濃度并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)［7］。取所有研究對(duì)象1 ml尿液置于EP管中，予離心處理，離心時(shí)間10 min；吸取上清液，并加入100 ml乙腈沉淀蛋白，漩渦混合后再次離心、吸取上清液去離子處理后漩渦混合、離心、吸取上清液，最后使用水系濾膜過(guò)濾樣品，色譜條件：Hypersil NH2柱（4.6 mm×250.0 mm，5μm），柱溫設(shè)置為25℃，示差檢測(cè)器：內(nèi)加熱32℃，進(jìn)樣檢測(cè)乳果糖和甘露醇含量，乙腈、水（80∶20，V/V），流速1 ml/min［8］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用±s表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，采用Pearson等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 UC組臨床特征分析UC組患者中，按嚴(yán)重程度分類(lèi)：輕度12例（32%），中度14例（36%），重度12例（32%）；按病變范圍分類(lèi)：全結(jié)腸炎12例（32%），左半結(jié)腸炎8例（21%），直乙狀結(jié)腸炎9例（23%），直腸炎9例（24%）。

2.2 兩組外周血MMP-2、MMP-9水平比較UC組外周血中MMP-2為（8.34±2.54）pg/L，MMP-9為（8.56±2.45）pg/L，正常對(duì)照組MMP-2為（1.91 ±0.30）pg/L，MMP-9為（2.14±0.31）pg/L，UC組MMP-2水平和MMP-9水平高于正常對(duì)照組（t＝2.414，P＜0.05；t＝2.576，P＜0.05）。

2.3 UC患者外周血MMP-2、MMP-9水平與主要臨床特征的關(guān)聯(lián)分析UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與病變程度和病變范圍均呈一定程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.692，P＜0.05；r＝0.661，P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.4 兩組L/M比值測(cè)定UC組的L和M排出的比值（0.057±0.020）與正常對(duì)照組的L和M排出比值（0.030±0.005）相比顯著升高（P＜0.05），表明UC患者腸黏膜通透性明顯增高。

2.5 UC患者的L/M測(cè)定與主要臨床特征的關(guān)聯(lián)分析UC患者L/M水平與病變程度和病變范圍均呈一定程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.794，P＜0.05；r＝0.728，P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.6 UC組患者外周血MMP-2、MMP-9水平與L/M比值關(guān)聯(lián)分析UC組患者外周血MMP-2、MMP-9水平與其L/M比值呈一定程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.844，P＜0.05；r＝0.861，P＜0.05）。

表1 UC組患者血MMP-2、MMP-9水平與臨床特征分析（±s）

表1 UC組患者血MMP-2、MMP-9水平與臨床特征分析（±s）

臨床特征nMMP-2（pg/L）P值F值MMP-9（pg/L）P值F值嚴(yán)重程度0.005147.90.007 199.49輕度124.07±0.705.39±0.51中度146.12±0.438.25±0.54重度1210.66±1.511.47±1.08病變范圍0.013 226.280.019 208.35全結(jié)腸炎1212.37±1.1213.11±1.07左半結(jié)腸炎89.56±0.549.41±0.53直乙狀結(jié)腸炎96.31±0.617.28±0.28直腸炎94.14±0.415.51±0.64

表2 活動(dòng)期UC患者L/M比值與臨床特征分析（±s）

表2 活動(dòng)期UC患者L/M比值與臨床特征分析（±s）

臨床特征nL/M比值P值嚴(yán)重程度＜0.05輕度120.032±0.008中度140.049±0.011重度120.067±0.014病變范圍＜0.05全結(jié)腸炎120.070±0.009左半結(jié)腸炎80.062±0.006直乙狀結(jié)腸炎90.043±0.009直腸炎90.031±0.005

3 討論

MMPs是降解ECM成分的蛋白水解酶，MMPs的活性增加可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸的上皮損傷，在與炎癥有關(guān)的組織破壞和重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用［9］。近年來(lái)有研究［10］顯示，MMPs在UC的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MMP-2和MMP-9在UC中主要降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原是基底膜主要成分，作為屏障起到阻止炎癥擴(kuò)散作用［11］。Garg et al［12］發(fā)現(xiàn)在炎癥性腸病（IBD）中MMP-9通過(guò)調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞減弱黏膜防御引起結(jié)腸炎癥。Meijer et al［13］檢測(cè)122例克隆恩?。–rohn＇s disease，CD）患者、20例UC患者及62例正常人回結(jié)腸標(biāo)本MMPs及TIMPs水平，發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2水平在CD和UC患者中均有明顯增高，且MMPs水平與結(jié)腸中髓過(guò)氧化物酶水平呈正相關(guān)。國(guó)內(nèi)研究［14］表明，MMP-2在UC患者病變組織中呈高表達(dá)。Von Lampe et al［15］檢測(cè)21例UC患者和21例CD患者結(jié)腸活檢標(biāo)本中MMPs及TIMPs mRNAs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UC和CD中MMP-2、MMP-1、MMP-4及TIMP-1 mRNAs表達(dá)顯著增加，表明MMPs在IBD的結(jié)腸組織破壞和重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明顯高于正常對(duì)照組，提示MMP-2、MMP-9可能參與UC的病理生理機(jī)制。通過(guò)UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與UC主要臨床特征的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)重度活動(dòng)期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明顯高于中度患者，同時(shí)不同病變范圍的活動(dòng)期IBD患者間MMP-2、MMP-9水平存在一定差別，表明活動(dòng)期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與疾病嚴(yán)重程度、病變范圍呈相關(guān)性。同時(shí)，外周血中MMP-2、MMP-9水平與腸黏膜通透性有良好相關(guān)性。

綜上所述，活動(dòng)期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明顯增高，與UC嚴(yán)重程度和病變范圍呈一定相關(guān)，提示MMP-2、MMP-9可能是腸黏膜通透性改變的關(guān)鍵分子，但參與UC發(fā)病及腸黏膜通透性改變還有很多其他重要的因素，有待于進(jìn)一步研究。

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The relationship between the expression of matrix metalloproteinases and intestinal mucosal permeability in patients with ulcerative colitis

Xue Yongju1，2，Mei Qiao1，Ding Hao，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，The Key Laboratory for Digestive Diseases of Anhui Province，Hefei 230022；2Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003）

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of matrix metalloproteinases（MMPs）and intestinal mucosal permeability in patients with ulcerative colitis.Methods38 UC patients and 30healthy controls were enrolled in this study，the levels of MMP-2 and MMP-9 in the serum were assessed by ELISA method.Detected the lactulose and mannitol in urine of 38 UC patients and 30healthy people after they took orally the lactulose and mannitol test solution by HPLC-RI method and calculated the ratio of them.ResultsThe serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients were significantlyhigher than that inhealthy controls，which were correlated with the severity and extent of disease（P＜0.05）.The lactulose/mannitol ratio in 38 UC patients was signifi-cantlyhigher than that in 30 control people.The serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients were correlated with the the change of intestinal mucosal permeability.ConclusionThe serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients are significantly increased，which is correlated with the change of intestinal mucosal permeability.

MMP-2；MMP-9；ulcerative colitis；intestinal mucosal permeability

R 574.1

A

1000－1492（2014）04－0495－04

2013－11－25接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：09020103010）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001

2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，蚌埠 233003

薛永舉，男，主治醫(yī)師；梅 俏，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：meiqiao＠hotmail.com