夏 瓊，徐星銘

CXCL16及CXCL10在狼瘡性腎炎患者中的表達(dá)及與疾病活動(dòng)的相關(guān)性

夏 瓊，徐星銘

目的探討趨化因子配體16（CXCL16）及趨化因子配體10（CXCL10）在狼瘡性腎炎（LN）患者血清、尿液以及腎臟內(nèi)的表達(dá)以及與疾病活動(dòng)的關(guān)系。方法ELISA法檢測(cè)LN患者及正常對(duì)照者血清、尿液中CXCL16、CXCL10的表達(dá)水平，免疫組化法檢測(cè)經(jīng)腎臟活檢確診為L(zhǎng)N的患者以及正常對(duì)照者腎臟組織中的CXCL16的表達(dá)水平。結(jié)果

狼瘡性腎炎；CXCL16；CXCL10

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)，以T、B淋巴細(xì)胞功能異常為主要特征的自身免疫性疾病，有著復(fù)雜的細(xì)胞及細(xì)胞因子的相互作用。趨化因子作為重要的細(xì)胞因子之一，在介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用以及調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫平衡起著至關(guān)重要的作用。研究［1］表明，趨化因子配體10（CXCL10）可能參與SLE的發(fā)病過(guò)程，并與SLE活動(dòng)度有關(guān)，通過(guò)與受體CXCR3結(jié)合誘導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集到炎癥部位并釋放細(xì)胞因子。趨化因子配體16（CXCL16）作為CXC家族的新成員［2］，通過(guò)特異性與CXCR6結(jié)合從而募集T細(xì)胞、NKT細(xì)胞到達(dá)不同組織啟動(dòng)多種急慢性炎癥。在狼瘡小鼠中可見(jiàn)血液以及尿液的CXCL16的表達(dá)有所增加，且與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）評(píng)分有關(guān)［3］，但關(guān)于CXCL16在狼瘡性腎炎（LN）患者腎內(nèi)的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)檢測(cè)CXCL10、CXCL16體內(nèi)水平，揭示二者可能參與疾病發(fā)病機(jī)制，并為臨床評(píng)估提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年3月～2013年3月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科76例住院患者血清（其中43例患者同時(shí)留取尿液），其中男7例，女69例，年齡14～59（33.34±11.7）歲。所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（ARA）修訂的SLE標(biāo)準(zhǔn)。收集14例門(mén)診健康體檢者（各項(xiàng)生化指標(biāo)正常、自身抗體陰性、無(wú)糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾?。┑难搴湍蛞鹤鳛檎?duì)照組，其中男2例，女12例，年齡18～35（26.35±5.24）歲。76例患者中有41例經(jīng)腎臟活檢確診為L(zhǎng)N（Ⅲ型7例，Ⅳ型26例，Ⅴ型8例）。選取10例泌尿外科腎腫瘤切除患者遠(yuǎn)離腫瘤部位至少2 cm的腎臟組織作為正常腎臟組織對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)符合院倫理委員會(huì)要求，入選患者均知情并簽署同意書(shū)。

1.2 主要試劑CXCL16、CXCL10的ELISA試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技公司；兔抗人CXCL16單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（ab101404）；正常山羊血清封閉液、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、二抗試劑盒（試劑B、C分別為生物素化通用二抗工作液，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液）、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料及相關(guān)指標(biāo)的收集 記錄患者入院后所檢測(cè)的臨床指標(biāo)，包括血尿常規(guī)、肝腎功能、免疫球蛋白＋補(bǔ)體、24h尿蛋白定量、腎臟活檢病理類(lèi)型等，并計(jì)算患者的SLEDAI評(píng)分。LN患者及正常對(duì)照者清晨空腹常規(guī)肘靜脈采血3 ml置于含有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，LN患者的尿液一般收集于首次入院后，正常對(duì)照者收集于門(mén)診的隨機(jī)尿，后均以2 500 r/min離心10 min，分離上清液置于－80℃冰箱留待測(cè)定。

1.3.2 ELISA法測(cè)定CXCL16、CXCL10水平 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別測(cè)定血清及尿液中CXCL16、CXCL10水平。

1.3.3 免疫組化 石蠟切片（2 μm）脫蠟，水化，微波修復(fù)，H2O2孵育，封閉后加入一抗（1∶100），4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，后B、C試劑孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，PBS返藍(lán)，脫水，封片。免疫組化圖片使用Image Pro-Plus 16.0圖像分析軟件處理，以高倍鏡下累計(jì)光密度（IOD）平均值代表該患者腎內(nèi)CXCL16表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，指標(biāo)相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中CXCL16、CXCL10的表達(dá)ELISA法檢測(cè)LN組血清CXCL16水平高于正常對(duì)照組（P＜0.05，F(xiàn)＝0.56，t＝2.44），CXCL10同樣升高（P＜0.05，F(xiàn)＝2.94，t＝3.97），見(jiàn)表1。Pearson線性相關(guān)分析提示二者血清中的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.68，P＜0.01）。方差分析顯示Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型LN之間的血清CXCL16、CXCL10表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 LN患者與正常對(duì)照者血清CXCL16、CXCL10表達(dá)水平（μg/L，±s）

表1 LN患者與正常對(duì)照者血清CXCL16、CXCL10表達(dá)水平（μg/L，±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05

組別n CXCL10CXCL16正常對(duì)照146.48±2.212.31±0.73 LN7610.59±3.72*2.99±0.98*Ⅲ型78.24±2.432.68±0.54Ⅳ型2611.17±3.26*3.12±1.01*Ⅴ型89.46±1.93*2.84±0.91*

2.2 尿液中CXCL16、CXCL10的表達(dá)ELISA法檢測(cè)LN組尿液中的CXCL16、CXCL10表達(dá)均高于正常對(duì)照組（P＜0.01，F(xiàn)＝1.26、2.43，t＝3.72、2.82），見(jiàn)表2。Pearson相關(guān)分析提示LN組CXCL10的尿液表達(dá)水平與其血清中的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.40，P＜0.05），LN組尿液CXCL16表達(dá)水平與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.34，P＜0.05），見(jiàn)圖1。Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型之間的尿液CXCL16、CXCL10表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 LN患者與正常對(duì)照者尿液CXCL16、CXCL10表達(dá)水平（μg/L，±s）

表2 LN患者與正常對(duì)照者尿液CXCL16、CXCL10表達(dá)水平（μg/L，±s）

與正常對(duì)照組比較：**P＜0.01，*P＜0.05

組別n CXCL10CXCL16正常對(duì)照146.81±0.902.51±0.37 LN438.07±1.52**3.12±0.56**Ⅲ型77.63±1.45*2.88±0.45*Ⅳ型268.16±1.59**3.20±0.76**Ⅴ型87.96±1.23**3.01±0.57**

圖1 尿液中CXCL10與血清CXCL10、尿液CXCL16水平與SLEDAI評(píng)分的散點(diǎn)圖

2.3 腎臟中CXCL16的表達(dá)在正常對(duì)照者的腎臟組織中可見(jiàn)CXCL16在腎小管上皮細(xì)胞有較強(qiáng)的表達(dá)，但在腎小球未見(jiàn)表達(dá)，LN組的腎臟組織可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞CXCL16的表達(dá)增加，小球中亦可見(jiàn)到表達(dá)，見(jiàn)圖2。LN組IOD值較正常對(duì)照組表達(dá)增加（P＜0.05），方差分析提示Ⅳ型的IOD值較Ⅲ型、Ⅴ型LN患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但Ⅲ型、Ⅴ型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

2.4 CXCL16、CXCL10在血清中的表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析CXCL10的血清水平與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.39，P＜0.01），與補(bǔ)體C3呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.49，P＜0.01），與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血清IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體C4以及24h尿蛋白等指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。CXCL16的血清水平與SLEDAI、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血清IgG、IgA、IgM以及24h尿蛋白等指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。

表3 LN患者與正常對(duì)照者腎內(nèi)CXCL16水平（±s）

表3 LN患者與正常對(duì)照者腎內(nèi)CXCL16水平（±s）

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圖2 正常腎臟組織以及LN患者腎內(nèi)CXCL16的表達(dá) SP×400

2.5 CXCL16、CXCL10在尿液中的表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析尿液中CXCL10的水平與SLEDAI評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血清IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4以及24h尿蛋白等指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，CXCL16的尿液水平與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.34，P＜0.05），與其他指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性。

3 討論

CXCL16一般以膜結(jié)合型、分泌型兩種形式存在，具有主要功能的為分泌型。膜結(jié)合型的CXCL16在抗原遞呈細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)?？扇苄訡XCL16由細(xì)胞膜上的金屬蛋白水解酶10裂解切割巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上的膜結(jié)合型CXCL16后分泌產(chǎn)生，在效應(yīng)T細(xì)胞的遷移、細(xì)胞免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)、新生血管以及動(dòng)脈硬化中發(fā)揮十分重要的作用［4－5］。與以往報(bào)道類(lèi)似［3，6］，本實(shí)驗(yàn)顯示LN患者的血清以及尿液中的CXCL16水平均較正常對(duì)照者明顯上升，并且尿液中CXCL16水平與SLEDAI呈正相關(guān)。在MRL-lpr小鼠中，CXCL16 mRNA水平明顯增高［7］。這些均提示了CXCL16可能參與了SLE的免疫應(yīng)答，且本研究顯示無(wú)論在正常對(duì)照組還是LN組尿液中的CXCL16水平均高于血清中的水平，提示CXCL16除了來(lái)源于血清還可能來(lái)源于腎臟，但其在疾病中的作用有待進(jìn)一步研究。

在實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)抗腎小球基底膜抗體相關(guān)腎小球腎炎中［8］，CXCL16在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，在腎小球急進(jìn)性炎癥進(jìn)展階段，阻斷CXCL16可以顯著減弱單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)以及腎小球的損傷，蛋白尿也得到了緩解。在糖尿病腎病小鼠［9］中CXCL16更多地分布在腎小球中的足細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化證實(shí)了在正常對(duì)照組CXCL16較多表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，腎小球很少表達(dá)［10］，但LN組患者中發(fā)現(xiàn)腎小管、小球的表達(dá)量較正常對(duì)照組均上升，尤其是腎小球的表達(dá)量明顯增加，Ⅳ型LN的表達(dá)量較Ⅲ型、Ⅴ型尤為升高，Ⅳ型為L(zhǎng)N患者中病理程度最為嚴(yán)重的一種，提示CXCL16可能參與了LN的病理發(fā)展過(guò)程。

CXCL10是較早發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，之前研究較多。與之前的研究結(jié)果相似［1，11］，本實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了LN組CXCL10水平較正常對(duì)照者明顯上升，并與SLEDAI呈正相關(guān)，與補(bǔ)體C3呈負(fù)相關(guān)。兒童LN患者［12］的血清中CXCL10同樣明顯上升，而且外周血中的CXCR3＋CD4＋T細(xì)胞則下降，可能與腎內(nèi)組織高表達(dá)的CXCL10遷移了外周T細(xì)胞有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)未行腎臟組織CXCL10的免疫組化，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)涉及。

已有研究［13］表明在Ⅳ型LN患者的尿液沉渣細(xì)胞中CXCL10和受體CXCR3 mRNA水平較Ⅲ型、Ⅴ型有所上升，本研究中ELISA法同時(shí)檢測(cè)了尿液中的CXCL10的水平，發(fā)現(xiàn)LN組也高于正常對(duì)照組，并且尿液中的表達(dá)水平與血清中CXCL10的表達(dá)呈正相關(guān)，雖然尿液CXCL10的水平與SLEDAI無(wú)明顯相關(guān)性，但應(yīng)考慮到在LN組患者中CXCL10的尿液水平小于血清，血清水平更能代表其體內(nèi)的CXCL10水平，而CXCL16剛好相反，尿液水平表示其體內(nèi)總體水平更為合適。聯(lián)合二者之間對(duì)于臨床判斷SLE活動(dòng)程度有一定的意義，但由于現(xiàn)有LN的研究中關(guān)于CXCL16的報(bào)道較少，是否與CXCL10之間存在相互關(guān)系仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Expression of CXCL16 and CXCL10 correlates with disease activity in lupus nephritis patients

Xia Qiong，Xu Xingming
（Dept of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo discuss the expression of CXC Chemokine Ligand 16（CXCL16）and CXC Chemokine Ligand 10（CXCL10）in serum，urine and renal tissue in lupus nephritis（LN）.MethodsThe serum and urine levels of CXCL10，CXCL16 were assessed by ELISA in LN patients and normal controls.Immunohistochemistry was used to detect the renal tissue expressions of CXCL16 in patients andhealthy controls.ResultsThe serum and urine concentrations of CXCL10 and CXCL16 were significantlyhigher in LN patients than those inhealthy controls（P＜0.01）.In addition，the level of serum CXCL10 showed positive correlation with SLEDAI and negative correlation with serum C3 level（P＜0.01），the expression of urine CXCL16 showed positive correlation with SLEDAI（P＜0.05）.Inhealthy renal tissues CXCL16 was distributed mainly in renal tubules and rarely seen in glomerular cells while the expressions in renal tubules increased and glomeruli stainings were found in LN paitients.CXCL16 expressed significantly in LN patients than normal controls（P＜0.05）.Besides，different concentrations of CXCL16 were observed inⅢ，ⅣandⅤLN，the expressions of CXCL16 inⅣLN werehigher than those inⅢLN andⅤLN（P＜0.01），while no difference between theⅢLN andⅤLN.ConclusionCXCL10 and CXCL16 may play key roles in the pathogenesis of LN and both of CXCL10 in serum and CXCL16 in urine may be useful as markers of disease activity.The change of CXCL16 may associate with the pathology category of LN.

lupus nephritis；CXCL16；CXCL10

R 593.242

A

1000－1492（2014）04－0491－04

2013－11－25接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30572356）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，合肥 230022

夏 瓊，女，碩士研究生；徐星銘，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xxm2425＠163.com

LN患者血清以及尿液中的CXCL16、CXCL10與正常對(duì)照者比較均升高（P＜0.01），且血清中CXCL10水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.39，P＜0.01），與補(bǔ)體C3呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.49，P＜0.01），尿液中CXCL16水平與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.34，P＜0.05）。正常對(duì)照組腎臟的小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)CXCL16較強(qiáng)的表達(dá)，腎小球很少表達(dá)，但在LN患者可見(jiàn)小管中表達(dá)有所增強(qiáng)，小球中明顯增強(qiáng)，其腎內(nèi)的CXCL16的表達(dá)水平較正常對(duì)照組上升（P＜0.05），尤以Ⅳ型顯著（P＜0.05）。結(jié)論CXCL10、CXCL16可能參與LN的發(fā)病過(guò)程，血清CXCL10和尿液中CXCL16水平的檢測(cè)對(duì)于判斷疾病的臨床活動(dòng)具有一定的意義，其中CXCL16可能與LN的病理變化有關(guān)。