侯菲菲，沈 彤，王 進(jìn)，房 魏，張 澄，朱啟星

三氯乙烯對小鼠肝臟PPARα和PPARγ表達(dá)的影響

侯菲菲1，沈 彤1，王 進(jìn)1，房 魏1，張 澄2，朱啟星2

目的探討飲水?dāng)z入三氯乙烯（TCE）對小鼠肝臟過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）α和PPARγ的影響。方法雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組、2.5 g/L TCE組和5.0 g/L TCE組，TCE經(jīng)飲水暴露。分別在第2、4、8、12周時(shí)，取外周血檢測肝功能；處死小鼠取肝臟組織，HE染色進(jìn)行病理觀察；分別采用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR法和免疫組化法檢測PPARα和PPARγ的mRNA水平和蛋白表達(dá)。結(jié)果與空白對照組及溶劑對照組比較，2.5、5.0 g/L TCE組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平在第2、4周明顯升高（P＜0.05）；HE染色顯示2.5、5.0 g/L TCE組小鼠肝臟組織有明顯炎細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞變性，肝損傷在4周時(shí)最明顯；與空白對照組及溶劑對照組比較，2.5、5.0 g/L TCE組小鼠肝臟中PPARα和PPARγ mRNA表達(dá)量在4、8、12周時(shí)明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；2.5、5.0 g/L TCE組小鼠肝臟組織細(xì)胞核中均見PPARα和PPARγ的陽性表達(dá)，與空白對照組及溶劑對照組比較，各時(shí)期肝臟細(xì)胞核PPARα和PPARγ的陽性表達(dá)率顯著上升（P＜0.05）。結(jié)論飲水?dāng)z入TCE能上調(diào)小鼠肝臟PPARα和PPARγ表達(dá)。

三氯乙烯；PPARα；PPARγ；肝毒性

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是工業(yè)上廣泛應(yīng)用的氯代類有機(jī)溶劑，除職業(yè)暴露外，由于大量應(yīng)用加之處置不當(dāng)，其已大量進(jìn)入大氣、土壤和地下水系統(tǒng)，成為一種重要的環(huán)境污染物［1］。職業(yè)環(huán)境中TCE暴露主要通過呼吸道和皮膚，而普通人群的TCE暴露主要是通過飲水?dāng)z入。TCE可引起機(jī)體多臟器損害，在TCE職業(yè)暴露人群中發(fā)生的TCE藥疹樣皮炎，患者在出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚損害的同時(shí)還表現(xiàn)出明顯的肝臟損害［2］。研究［3］顯示長期TCE攝入主要引起肝臟毒性，目前TCE長期暴露引起肝臟毒性的具體機(jī)制還不清楚。研究［4］表明許多環(huán)境毒物所致肝臟毒性與其誘導(dǎo)核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）表達(dá)相關(guān)。該研究通過檢測經(jīng)飲水?dāng)z入TCE小鼠肝臟損傷和肝臟中PPARα和PPARγ的表達(dá)情況，探討TCE暴露對小鼠肝臟PPARs表達(dá)的影響及其與肝臟毒性的關(guān)系，為防治TCE危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TCE和二甲基亞砜（DMSO）為分析純（美國Sigma公司）；RNA抽提試劑盒（美國QIAGEN公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；兔抗小鼠PPARα單克隆抗體和兔抗小鼠PPARγ單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；正常山羊血清封閉液（武漢博士德生物工程有限公司）；快捷性酶標(biāo)羊抗兔IgG（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR儀（美國AB公司）；Universal 320/320R型臺式低溫高速離心機(jī)（德國Hettich公司）；羅氏P800全自動生化儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及處理80只6周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級，體重16～18 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于清潔動物房，維持12h光照/黑暗晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組、2.5 g/L TCE組和5.0 g/L TCE組。TCE用DMSO溶解（終濃度不超過1%）后經(jīng)飲水?dāng)z入，每天記錄動物飲水量，為保持飲水中TCE濃度，每2 d換水1次；小鼠每周稱重1次；分別在第2、4、8、12周時(shí)摘眼球取血，處死小鼠無菌取肝臟，稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)（肝臟重量/體重）。

1.3 肝功能檢測外周血4℃靜置1h后3 000 r/min離心10 min，取血清，全自動生化儀檢測肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。

1.4 肝臟組織病理學(xué)檢查取新鮮肝臟組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋制備組織蠟塊，連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡觀察組織病理學(xué)改變。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測肝臟PPARα和PPARγ mRNA水平取新鮮肝臟制備勻漿，用RNA抽提試劑盒提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按如下程序進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，87℃10 s。以GAPDH為內(nèi)參，用2－ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)量。引物序列為：PPARα：5′-GGGTACCACTACGGAGTTCACG-3′（上游），5′-CAGACAGGCACTTGTGAAAACG-3′（下游）；PPARγ：5′-TGACCACTCCCATTCCTTT-3′（上游），5′-GCTCTACTTTGATCGCACTTT-3′（下游）；GAPDH：5′-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3′（上游），5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′（下游）。

1.6 免疫組化法檢測肝臟PPARα和PPARγ蛋白表達(dá)取新鮮肝臟組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋制備組織蠟塊。切片后常規(guī)脫蠟水化，Triton X-100細(xì)胞通透，雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，滴加一抗（1∶500），4℃過夜，第2天取出洗凈后滴加二抗，PBS充分沖洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，干燥，封片。陰性對照以等量PBS代替一抗，其他步驟同上。PPARα和PPARγ細(xì)胞核陽性表達(dá)率計(jì)算：400倍鏡下選取5個(gè)具有代表性的視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比，并求其平均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布的資料用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間的比較，用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠一般情況良好，未出現(xiàn)個(gè)體因TCE攝入而死亡，各組小鼠平均飲水量和體重增長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟系數(shù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 飲水?dāng)z入TCE對小鼠肝功能的影響在2、4、8、12周，溶劑對照組小鼠肝臟ALT水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在2、4周，2.5、5.0 g/L TCE組ALT水平較對照組有所升高，并且5.0 g/L TCE組的升高趨勢比2.5 g/L TCE組更加明顯（P＜0.05，P＜0.01）；在8、12周，2.5、5.0 g/L TCE組ALT水平有所下降，但仍高于對照組，只有5.0 g/L TCE組ALT水平顯著高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），其他組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.3 飲水?dāng)z入TCE對小鼠肝臟組織病理學(xué)影響組織病理檢查顯示，空白對照組和溶劑對照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，胞核大而圓，核仁明顯，胞質(zhì)均勻，無炎性改變（圖2A、B）；TCE暴露組小鼠肝臟組織匯管周圍見明顯炎細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞輕度水腫，少許細(xì)胞變性或壞死，4周時(shí)最明顯（圖2F），且5.0 g/L組（圖2F）較2.5 g/L組（圖2E）顯著，在8周（圖2G、H）和12周時(shí)損傷程度有所減輕。

2.4 飲水?dāng)z入TCE對小鼠肝臟PPARα、PPARγmRNA水平的影響在2、4、8、12周，溶劑對照組小鼠肝臟PPARα和PPARγ mRNA水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在4、8、12周，TCE暴露組PPARα mRNA水平高于空白對照組和溶劑對照組，且5.0 g/L TCE組上升趨勢高于2.5 g/L TCE組（P＜0.05，P＜0.01）；在4周時(shí)，2.5、5.0 g/L TCE組PPARγ mRNA水平均高于空白對照組和溶劑對照組（P＜0.05）；在8、12周，5.0 g/L TCE組PPARγ mRNA水平高于空白對照組和溶劑對照組（P＜0.05，P＜0.01），2.5 g/L TCE組PPARγ mRNA水平顯著高于空白對照組（P＜0.01），與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在2周時(shí)，除5.0 g/L TCE組PPARγ mRNA水平高于空白對照組外（P＜0.05），其他組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

2.5 飲水?dāng)z入TCE對小鼠肝臟PPARα、PPARγ蛋白表達(dá)影響免疫組化檢測顯示PPARα和PPARγ陽性表達(dá)細(xì)胞呈棕褐色，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，偶有胞質(zhì)表達(dá)，陰性表達(dá)細(xì)胞呈淡藍(lán)紫色?？瞻讓φ战M和溶劑對照組肝組織少見PPARα和PPARγ陽性表達(dá)，TCE暴露組小鼠肝臟組織各時(shí)期均顯示PPARα和PPARγ陽性表達(dá)，見圖4、5。統(tǒng)計(jì)顯示TCE暴露組肝組織胞核PPARα、PPARγ陽性表達(dá)率顯著高于空白對照組和溶劑對照組（P＜0.05），見表1。

圖1 飲水?dāng)z入TCE對小鼠ALT的影響（n＝5）

表1 肝臟PPARα、PPARγ細(xì)胞核陽性表達(dá)率（n＝3，±s）

表1 肝臟PPARα、PPARγ細(xì)胞核陽性表達(dá)率（n＝3，±s）

與空白對照組比較：*P＜0.05；與溶劑對照組比較：＃P＜0.05

項(xiàng)目組別2周4周8周12周PPARα空白對照0.020 0±0.001 80.023 8±0.003 80.019 4±0.003 50.025 0±0.006 1溶劑對照0.022 5±0.002 50.026 0±0.005 60.023 7±0.005 00.025 3±0.003 1 2.5 g/L TCE0.039 2±0.005 9*＃0.066 7±0.013 4*＃0.058 2±0.003 9*＃0.057 6±0.003 8*＃5.0 g/L TCE0.043 1±0.003 4*＃0.084 3±0.008 3*＃0.081 3±0.008 5*＃0.078 1±0.004 8*＃PPARγ空白對照0.017 9±0.001 60.017 5±0.001 80.018 6±0.000 30.017 9±0.001 3溶劑對照0.018 0±0.000 70.017 2±0.001 50.020 7±0.002 90.018 9±0.001 1 2.5 g/L TCE0.047 3±0.008 6*＃0.065 0±0.012 7*＃0.062 7±0.016 5*＃0.056 2±0.005 4*＃5.0 g/L TCE0.061 0±0.001 7*＃0.103 6±0.022 9*＃0.086 1±0.004 3*＃0.079 4±0.003 0*＃

圖3 TCE飲水暴露小鼠肝臟PPARα、PPARγ mRNA表達(dá)情況（n＝5）

圖4 小鼠肝臟組織PPARα表達(dá) PV×400

圖5 小鼠肝臟組織PPARγ表達(dá) PV×400

3 討論

研究［5］顯示長期暴露于TCE可致肝毒性，誘發(fā)肝臟炎癥、肝臟腫瘤等肝臟損傷，但具體機(jī)制目前仍不清楚。本研究在經(jīng)飲水給予小鼠不同劑量［3］TCE后于不同時(shí)段進(jìn)行肝功能檢測顯示，長期飲水?dāng)z入TCE可引起小鼠肝功能ALT上升，并在4周時(shí)達(dá)到最高，表明長期暴露于TCE可引起肝功能的損害；組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步顯示TCE染毒小鼠肝臟胞水腫變性、炎細(xì)胞浸潤等不同程度的肝損傷改變，而且也是4周時(shí)最為明顯。

研究［6－7］顯示TCE在肝臟細(xì)胞色素P450酶作用下生成的三氯乙酸（TCA）、二氯乙酸（DCA）具有過氧化物酶體增殖物（PP）的特性，從而激活PP的受體PPARs。激活的PPARs主要與靶基因啟動子區(qū)的PPAR反應(yīng)元件（PPRE）的特定核苷酸序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄；PPARs還可通過配體依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制核因子-κB（NF-κB）等表達(dá)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［8］。PPARs有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ 3種亞型，Corton［9］認(rèn)為PPARα在TCE誘發(fā)肝臟腫瘤中扮演著重要角色。本研究顯示，飲水給予TCE引起小鼠肝臟PPARα和PPARγ mRNA水平上調(diào)，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的TCE暴露引起PPARα mRNA表達(dá)量出現(xiàn)顯著增加一致；免疫組化檢測顯示TCE染毒動物肝臟細(xì)胞核PPARα和PPARγ的陽性表達(dá)較對照高，表明飲水?dāng)z入TCE后PPARα和PPARγ可能被激活；PPARα和PPARγ的表達(dá)在攝入TCE高劑量時(shí)較低劑量時(shí)明顯，且在TCE暴露4周時(shí)達(dá)最高與肝臟毒性的劑量和時(shí)間效應(yīng)表現(xiàn)一致，由此推測，飲水?dāng)z入TCE導(dǎo)致的肝臟毒性可能與PPARα和PPARγ的激活有關(guān)。但本研究中并未觀察到染毒小鼠肝臟出現(xiàn)增殖腫大現(xiàn)象，肝臟系數(shù)變化也沒有明顯差異，這可能與樣本數(shù)量和小鼠的種屬與品系有關(guān)。本研究未對PPARα和PPARγ蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，因此不能對PPARα和PPARγ表達(dá)與TCE暴露所致肝損害進(jìn)行相關(guān)性分析。

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Effects of trichloroethylene on the expression of liver PPARα and PPARγ in mice

Hou Feifei，Shen Tong，Wang Jin，et al
（Dept of Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effects of trichloroethylene（TCE）intake via drinking water on liver peroxisome proliferator activated receptor（PPAR）α and PPARγ in mice.MethodsThe female BALB/c mice were randomly divided into blank control group，vehicle control group，2.5 g/L TCE group and 5.0 g/L TCE group，and were exposed to TCE via drinking water.On the 2nd，4th，8th，12th week，blood was collected for liver function examination，liver tissues were taken for HE staining.The PPARα and PPARγ expression in liver were measured by RT-PCR and immunohistochemical staining.ResultsThe levels of ALT in 2.5，5.0 g/L TCE treated groups increased significantly compared with control groups on the 2nd，4th week（P＜0.05）；HE staining showed inflammatory cell infiltration and liver cell degeneration in 2.5，5.0 g/L TCE treated groups，the damage was most obvious on the 4th week；compared with control groups，PPARα and PPARγ mRNA expression in liver of TCE treated groups increased significantly on the 4th，8th，12th week（P＜0.05，P＜0.01）；in the nuclei of liver cells，the expression of PPARα and PPARγ was positive in 2.5，5.0 g/L TCE treated groups，and the levels of PPARα and PPARγ expression in nuclei increased significantly compared with control groups on the 2nd，4th，8th，12th week（P＜0.05）.ConclusionThe results suggest that TCE intake via drinking water can upregulate the expression of liver PPARα and PPARγ in mice.

trichloroethylene；PPARα；PPARγ；hepatotoxicity

R 114

A

1000－1492（2014）04－0467－05

2013－11－25接收

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：11040606M213）；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：210100）

安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院1衛(wèi)生毒理學(xué)系、2勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生系，合肥 230032

侯菲菲，女，碩士研究生；沈 彤，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ahmusht＠163.com