張亨國，劉向輝，孫衛(wèi)革，張 磊，沈 彬，葉長林

Micro CT應(yīng)用于犬即刻種植即刻加載后種植體－骨界面骨結(jié)合的研究

張亨國，劉向輝，孫衛(wèi)革，張 磊，沈 彬，葉長林

目的應(yīng)用Micro CT對即刻種植即刻加載后種植體－骨界面骨結(jié)合情況進行研究。方法4只Beagle犬，拔除其雙側(cè)下頜第3、4前磨牙，在相應(yīng)的拔牙窩選擇最佳位置即刻植入DIO種植體（直徑3.8 mm，長度10.0 mm）各1顆，同期連接基臺（直徑3.8 mm，長度6.0 mm）。術(shù)后24h內(nèi)采用種植體垂直加載儀進行垂直加載，將每只犬下頜的4枚種植體按照加載力的不同分為：對照組（不加載），加載5、10、15 N組，加載頻率為2 Hz，加載時間為每天15 min。開始加載后第4、8周后各處死2只Beagle犬，制作離體犬下頜骨標本并用Micro CT掃描，以CTAn軟件分析掃描后圖像，取與種植體相鄰的感興趣區(qū)行骨密度（BMD）及骨計量學分析。結(jié)果①加載4周時，加載10 N組與加載5、15 N組以及對照組在BMD、骨小梁數(shù)目、厚度、形態(tài)等方面差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。②加載8周時，加載10 N組與加載5、15 N組以及對照組在骨小梁數(shù)目、厚度、形態(tài)等方面差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。③加載8周時，在骨小梁數(shù)目、厚度、形態(tài)等方面，加載15 N組與加載5、10 N組及對照組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論應(yīng)用Micro CT對種植體－骨界面新生骨骨小梁情況進行分析，客觀地對不同加載時期不同加載項下種植體－骨界面骨結(jié)合情況進行了評估，為牙即刻種植術(shù)及術(shù)后即刻加載提供了理論依據(jù)。

Micro CT；即刻種植；即刻加載；種植體骨界面；骨結(jié)合

Branemark et al［1］提出的經(jīng)典種植理論認為：種植體在良好的初始穩(wěn)定性基礎(chǔ)上，必須要有至少3個月的無干擾無負載愈合期，以達到理想的骨結(jié)合。隨著即刻種植即刻負載理論應(yīng)用于口腔臨床中，避免了患者漫長的無牙等待過程以及二次手術(shù)帶來的不便。該研究基于Micro CT掃描及相應(yīng)三維重建軟件對不同加載載荷及不同加載時期骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁等情況進行分析計算，了解不同加載力作用下，不同加載期骨結(jié)合的情況，為即刻種植術(shù)及術(shù)后即刻負載提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4只成年雄性Beagle犬，體重（15.0±0.5）kg，全身及口腔無疾病，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學中心提供。

1.1.2 種植系統(tǒng)及主要實驗設(shè)備 韓國DIO種植系統(tǒng)，種植體（3.8 mm×10.0 mm）及基臺（3.8 mm ×6.0 mm）、種植體垂直加載儀（加載頻率2 Hz，載荷5～50 N）由長安集團力學實驗室制作；Micro CT（SkyScan1176，比利時SkyScan公司）。

1.2 方法

1.2.1 種植體即刻種植手術(shù)及術(shù)后垂直即刻加載

術(shù)前給予實驗犬肌注氯胺酮0.5 mg/kg、阿托品0.3 mg/kg、地西泮0.3 mg/kg復合麻醉，術(shù)中以丙泊酚靜脈滴注控制麻醉深度，確保實驗犬可自主呼吸。全麻生效后，微創(chuàng)拔除實驗犬雙側(cè)下頜第3、4前磨牙，逐級預備種植體窩洞，預備中及預備完成后以0.9%生理鹽水反復沖洗窩洞，將DIO種植體植入預備好的窩洞中，所有種植體植入扭矩均在35～55 N·cm。每只犬左右下頜分別植入2枚種植體，加載項種植體安放直徑3.8 mm，長度6.0 mm的基臺，不加載項安放愈合螺絲。4只犬共計植入16枚種植體及12枚配套基臺。將每只犬下頜的4枚種植體按照加載力的不同分為：對照組（不加載）（左下頜第4前磨牙）、加載5 N組（右下頜第4前磨牙）、加載10 N組（右下頜第3前磨牙）、加載15 N組（左下頜第3前磨牙），常規(guī)縫合種植創(chuàng)口。術(shù)后即開始給予實驗犬流質(zhì)飲食。術(shù)后24h開始加載，每天1次。每天加載前肌注氯胺酮0.5 mg/kg、阿托品0.3 mg/kg、地西泮0.3 mg/kg復合麻醉，待麻醉生效后，先檢查每顆種植體的穩(wěn)定情況，然后以1∶5 000洗必泰液沖洗實驗犬口腔（同時使用吸唾器及時吸出，保證實驗犬呼吸順暢），最后固定其下頜于加載儀加載臺上，以2 Hz頻率保持垂直于種植體基臺加載，加載載荷分別為5、10、15 N，每次加載15 min。

1.2.2 離體下頜體標本的制備及大體觀察 即刻種植術(shù)后即刻加載開始后的第4、8周分別處死2只實驗犬，考慮Micro CT機倉直徑6.8 cm，長度為20.0 cm，以無菌骨鋸自下頜角位置鋸開實驗犬下頜骨，完整取出下頜體并立即置入10%甲醛溶液中，4℃冰箱內(nèi)固定48h后，先進行大體觀察。

1.2.3 Micro CT掃描離體下頜骨 標本經(jīng)Micro CT對離體下頜骨進行掃描，掃描電壓為80 kV，電流313 μA，分辨率17.76 μm×17.76 μm×17.76 μm，掃描層厚17.76 μm，相機像素大小12.59 μm，每次旋轉(zhuǎn)角度為0.5°，共旋轉(zhuǎn)180°，單個標本掃描時間約為920 s，得到圖片約900張。

1.2.4 NRecon三維重建及感興趣體積（volume of interest，VOI）設(shè)定 根據(jù)Micro CT掃描后得到的圖片，使用NRecon軟件三維重建逐個標本中每枚種植體所在區(qū)段，重建單個區(qū)段耗時約50 min，得到圖片約400張。以CTAn軟件將重建后的圖像進行分析，挑選出種植體鈦金屬干擾弱掃描影像較好的圖像區(qū)段，實驗統(tǒng)一設(shè)定連續(xù)5張圖像為目標區(qū)段，每張圖像層厚為17.76 μm，即總層厚為88.8 μm。DIO種植體部分參數(shù)見圖1A，DIO種植體體部螺紋間距為0.8 mm，根據(jù)實際的植入體植入角度以及植入體對CT影像的干擾最小化原則，在種植體頰側(cè)、舌側(cè)、近中側(cè)或者遠中側(cè)（選擇種植體傾斜方向的對側(cè)，有利于避開種植體上端及基臺金屬干擾）選擇三處影像條件最佳的種植體體部螺紋間隙分配一塊直徑為0.37 mm的圓形狀目標感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）（見圖1B）。最終由連續(xù)5張目標區(qū)段圖像中圓形ROI組成了圓柱狀的VOI，VOI體積恒定為0.009 01 mm3，此VOI區(qū)域應(yīng)用于后續(xù)的BMD計算及骨微結(jié)構(gòu)分析。將此ROI保存并應(yīng)用于其他種植體周圍骨分析，以保證每枚種植體周圍恒定ROI面積及VOI體積。

1.2.5 VOI區(qū)域BMD測定 NRecon重建骨標準品后，以CTAn分析重建圖像，骨標準品低密度區(qū)域灰度閾值選擇48～58之間，得出并記錄衰減系數(shù)min值為0.005 0，高密度區(qū)域灰度閾值選擇為120～128之間，得出并記錄衰減系數(shù)max值為0.014 5。根據(jù)BMD衰減系數(shù)算法，分別輸入min值及max值，計算重建后的種植體圖像VOI的BMD，此處BMD結(jié)果選擇松質(zhì)骨區(qū)域。每枚種植體體部螺紋間各3個VOI分別計算BMD后，將同一加載時間及同一加載項的2枚種植體共計6個ROI位點的BMD求均值及標準差，即為該加載時間加載項種植體周圍骨組織的BMD數(shù)值，其單位為g/cm3。

圖1 DIO種植體及ROI的選擇

1.2.6 CTAn三維分析骨微結(jié)構(gòu)參數(shù) 運用CTAn軟件對各標本的VOI進行三維分析，所得參數(shù)包括：骨組織體積（tissue volume，TV）、骨小梁體積（trabecular bone volume，BV）、骨體積分數(shù)（percent bone volume，BV/TV）、骨組織表面積（bone surface，BS）、VOI交界面面積（intersection surface，IS）、骨組織復雜交錯指數(shù)（BS/BV）、骨小梁模式因素（trabecular bone pattern factor，Tb.Pf）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index，SMI）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁間隙（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）、骨孔隙體積（volume of pores，Po.V）、骨孔隙體積分數(shù)（percent porosity，Po）。TV數(shù)值指廣泛意義上的骨組織，包括骨小梁及骨小梁之間的孔隙，單位為立方毫米。BV數(shù)值指骨小梁的體積，單位為立方毫米。BV/TV為骨小梁體積占總骨組織體積的百分比，只有在骨小梁區(qū)域即松質(zhì)骨位置計算才有意義，對于皮質(zhì)骨區(qū)域，該數(shù)據(jù)無明確意義。BS為三維分析后的BS，單位為平方毫米。IS為VOI交界面骨小梁的面積，單位為平方毫米。BS/BV顯示的是骨組織的交錯厚薄復雜度，單位為毫米的倒數(shù)。Tb.Pf表示三維圖像中骨小梁相對于總的骨組織的一個凸度及凹度關(guān)系，單位為毫米的倒數(shù)。SMI是評價骨質(zhì)疏松的一個重要參數(shù)，其表示骨小梁是趨向桿狀還是趨向板狀結(jié)構(gòu)，理想的板狀、柱狀、球狀結(jié)構(gòu)，SMI分別指數(shù)為0、3、4，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，SMI增加，骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)退變，板狀結(jié)構(gòu)穿孔、消失，柱狀結(jié)構(gòu)比例增高。Tb.Th、Tb.Sp單位為毫米，Tb.N單位為毫米的倒數(shù)，Po.V單位為立方毫米。記錄每枚種植體周圍3處VOI區(qū)域三維分析后的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，最后將各加載期的各加載項下2枚種植體周圍6份骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)逐項求均值及標準差，所得數(shù)值為此加載周期加載項所得的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，分別對加載4、8周，加載5、10、15 N組及對照組間種植體周圍VOI區(qū)域BMD及各項骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)進行單因素方差分析，經(jīng)LSD、Dunnett檢驗，檢驗水準為α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察種植體周圍均未探及深牙周袋，用金屬口鏡柄敲擊種植體頂端可聽到清脆聲響。種植體均無臨床動度，創(chuàng)口愈合良好，黏膜無感染跡象。將下頜骨標本上牙周黏膜撕脫后，見8周加載期加載15 N組2枚種植體螺紋暴露，暴露區(qū)域未超過種植體頸部。

2.2 各組種植體周圍VOI區(qū)域BMD比較加載4周時，加載10 N組與加載5、15 N組及對照組間BMD比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），加載10 N組BMD最高，加載5 N組BMD最低。加載8周時，加載5、10、15 N組及對照組間BMD相互比較，差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 不同加載時間加載組與對照組種植體周圍VOI區(qū)域BMD（n＝16，g/cm3，±s）

表1 不同加載時間加載組與對照組種植體周圍VOI區(qū)域BMD（n＝16，g/cm3，±s）

與加載10 N組比較：*P＜0.05

時間（周）加載組5 N10 N15 N對照組F值40.752±0.121*0.976±0.1270.854±0.082*0.867±0.048*7.565 80.684±0.0780.623±0.0290.696±0.0740.695±0.0223.054

2.3 各組種植體周圍VOI區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)主要參數(shù)比較加載4周時，加載5、10、15 N組與對照組在BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Pf、SMI、Po方面差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），由均值差的符號及數(shù)值得出，加載10 N組在骨小梁數(shù)目、厚度、形態(tài)等方面最佳，加載15 N組最差。加載8周時，加載10 N組與加載5、15 N組、對照組在BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Pf、SMI、Po方面差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），加載15 N組與加載5 N組和對照組在BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Pf、SMI、Po方面差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），加載10 N組在骨小梁數(shù)目、厚度、形態(tài)等方面最佳，加載15 N組最差。加載8周時，加載5 N組與對照組在所有參數(shù)方面差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

3 討論

表2 不同加載時間加載組與對照組種植體周圍VOI區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)（n＝16，±s）

表2 不同加載時間加載組與對照組種植體周圍VOI區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)（n＝16，±s）

與加載4周時對照組比較：*P＜0.05；與加載4周時加載10 N組比較：△P＜0.05；與加載8周時對照組比較：＃P＜0.05；與加載8周時加載10 N組比較：▽P＜0.05

項目4周8周加載5 N組加載10 N組加載15 N組對照組F值加載5 N組加載10 N組加載15 N組對照組F值BV/TV（%）28.62±3.66*△31.78±4.13*26.23±5.27*△26.55±4.525.407 21.93±2.40▽24.59±3.92＃14.63±1.62＃▽21.65±3.517.784 Tb.Pf（mm－1）31.21±3.90*△27.86±5.34*31.60±4.99*△30.34±4.425.598 37.96±4.92▽33.58±4.95＃46.93±5.64＃▽38.18±4.716.336 SMI2.52±0.23*△2.50±0.23*2.54±0.26*△2.53±0.354.324 2.81±0.16▽2.66±0.15＃2.96±0.21＃▽2.76±0.255.462 Tb.Th（mm）0.048 0±0.004 1*△0.052 0±0.006 1*0.047 0±0.005 2*△0.050 0±0.004 94.786 0.044 0±0.004 8▽0.048 0±0.002 2＃0.042 0±0.003 2＃▽0.046 0±0.001 54.895 Tb.N（mm－1）5.80±0.83*△6.14±0.25*5.49±0.94*△5.81±0.754.658 5.01±0.87▽5.11±0.85＃3.52±0.61＃▽4.66±0.775.624 Po（%）71.98±3.66*△68.21±4.11*73.77±5.27*△72.26±4.836.482 78.07±2.40▽75.38±3.91＃85.37±1.62＃▽78.31±3.557.790

本實驗運用Micro CT針對即刻種植后即刻加載的不同加載期不同加載項下骨再生及骨改建情況進行了探討。本實驗中的所有種植體均有著良好的初期穩(wěn)定性，且始終處于穩(wěn)固狀態(tài)，每枚種植體植入后均形成了種植體－骨結(jié)合界面，只是不同加載載荷及加載期下種植體－骨結(jié)合界面新骨的生成及改建情況存在差異。Esposito et al［2］相關(guān)的大量臨床回顧性分析結(jié)果也表明，即刻加載與延期加載均可以形成種植體－骨組織之間骨性結(jié)合。

Brunski［3］關(guān)于種植體微動對骨結(jié)合影響的研究結(jié)果顯示：小于100 μm的微動可以獲得功能性的骨－種植體接觸界面，而大于150 μm的微動會干擾種植體周圍骨愈合，導致纖維包繞種植體。根據(jù)有限元分析Ko計算，在合理微動度（50～100 nm的應(yīng)變范圍）下，確定該實驗加載項分別為5、10、15 N，最終各項骨微參數(shù)顯示：相同加載期時10 N的加載載荷，對種植體－骨界面新骨的生成及改建有一定的促進意義，10 N的載荷與5、15 N及不加載項相比，是最佳的加載載荷值。吳丹等［4］即刻種植即刻負載相關(guān)研究認為，10 N載荷時骨吸收量最少，且新骨形成百分比最高，10 N考慮為最佳加載項。

實驗加載頻率為2 Hz，加載時間為15 min，系根據(jù)人體日常咀嚼活動中的正常咀嚼頻率（1～2 Hz）及咀嚼時間（20 min以內(nèi)）來設(shè)定，盡可能的在實驗犬口腔中模擬人體口腔內(nèi)咀嚼情況，最終結(jié)果也未顯示種植失敗以及其他種植術(shù)后并發(fā)癥。

DIO種植體在設(shè)計上存在優(yōu)勢，其種植體頸部雙螺紋存在0.4 mm的間隙，而體部單螺紋存在0.8 mm的間隙，同時在植體頸部到體部存在一定的內(nèi)聚角度，不同型號的植體一般此角度為6～8°，這樣既可以給予起主要支持作用的種植體體部非完全接觸骨組織而形成新骨及完成骨重建，又可以為骨生成提供更多的表面積，同時因為頸部密集的螺紋而擁有良好的種植體初期穩(wěn)定性繼而為種植體－骨結(jié)合提供穩(wěn)定支持。Puleo et al［5］研究認為非接觸成骨效率比接觸成骨效率高30%。Habibovic et al［6］相關(guān)研究認為，種植體為骨組織提供較多的表面積對細胞分化成骨有著積極的影響。由于種植體本身植入時偏移角度以及種植體本身頸部與體部內(nèi)聚角度，根據(jù)具體情況選擇ROI為種植體體部螺紋間直徑0.37 mm的圓形區(qū)域。該實驗將ROI選擇于相鄰種植體體部螺紋間，不僅使得ROI區(qū)域影響被種植體金屬干擾最小，而且能保證區(qū)域內(nèi)均為種植體－骨界面內(nèi)新生骨，最終可以準確的評估即刻種植即刻負載的骨結(jié)合情況。

實驗選擇4周加載期及8周加載期為數(shù)據(jù)采集點，系根據(jù)經(jīng)典骨愈合理論。一般骨愈合4周后骨小梁形成趨于穩(wěn)定，關(guān)鍵的骨重塑階段，即新生骨排列雜亂的骨小梁逐漸趨向規(guī)律，同時骨小梁增粗、增厚，幼稚的交織骨逐漸為成熟的板層骨所代替，骨質(zhì)連接更趨堅固。這一過程最終需要8周左右才能完成。Mai et al［7］在實驗兔體內(nèi)進行新型植體材料研究時，28 d及56 d時分別處死實驗動物并行硬組織切片，結(jié)果同樣顯示28 d時種植體周圍血管再生及骨再生較顯著，而56 d時骨重塑良好。吳晶等［8］研究認為4周時骨結(jié)合能力顯著增強，是種植體愈合期生物穩(wěn)定性的一個關(guān)鍵時間點，8周內(nèi)無負載種植體的最大剪切力及最大力矩與愈合時間呈正相關(guān)。Deguchi et al［9］認為3周的愈合期是必要的，有較多網(wǎng)狀骨組織形成，增加了骨性接觸。

骨愈合的進程中，骨小梁的情況客觀地反映了骨愈合的情況，而Micro CT可以精確的定量分析出實驗骨塊的骨小梁情況，進而宏觀并客觀地對不同加載時期不同加載項下種植體－骨界面新骨骨愈合及骨改建情況進行了分析比較，結(jié)果顯示：不論加載期是4周或8周，加載載荷為10 N時，骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁排列整齊度等方面均優(yōu)于其他各加載項，且骨小梁形態(tài)都趨于更穩(wěn)固的柱狀甚至板狀，所以即刻種植即刻加載10 N載荷可能是最佳加載力值。同時4周時10 N加載項與對照組骨小梁參數(shù)比較結(jié)果較8周時10 N加載項與對照組骨小梁參數(shù)比較結(jié)果更優(yōu)，提示加載早期10 N載荷對種植體－骨界面骨整合情況有一定的促進意義。在加載8周后，15 N的加載項不僅在骨小梁數(shù)目、厚度等方面較其他組差，而且其骨小梁排列錯雜、骨小梁形態(tài)趨于球狀，提示加載后期較大的15 N載荷，可能對于種植體－骨界面的骨重建有著不利影響。

綜上所述，在本實驗條件下，健康牙周組織前磨牙區(qū)即刻種植即刻負載是可行的，運用Micro CT及相應(yīng)的分析軟件，通過全面分析計算骨小梁相關(guān)參數(shù)，進而客觀地評估即刻種植即刻加載后種植體－骨界面骨結(jié)合情況，對臨床種植學的發(fā)展有著深刻意義。

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The osseointegration research of immediate loading of immediate implant on implant-bone interface in dogs by using Micro CT

Zhang Hengguo，Liu Xianghui，Sun Weige，et al
（Dept of Stomatology，College of Clinical Medicial，Anhui Medical University，PLA 81st Hospital，Nanjing 210002）

ObjectiveThe osseointegration research of immediate loading of immediate implant on implant-bone interface by using Micro CT.MethodsFour Beagle dogs were used.The bilateral mandibular third and fourth premolars were extracted，meanwhile DIO implants（3.8 mm in diameter and 10.0 mm in length）and DIO abutments（3.8 mm in diameter and 6.0 mm in length）were immediately implanted in the corresponding tooth fossa of each dog.A technical device was applied to the vertical loading of the immediate implants at 24h after the operation.The implants were divided into four groups including a 5 N group，a 10 N group，a 15 N group and a control group according to the load.Each group was loaded with 2 Hz frequency for 15 min everyday.Two dogs were sacrificed at 4 weeks and two dogs at 8 weeks to prepare the mandibular specimens in vitro.Many images were generated by Micro CT which scanned the mandibular specimens.After software CTAn was used to analyze the scan images，chose the interest regions adjacent to implant and analysed the bone mineral density and microstructure measurement.ResultsCompared 4 weeks with 8 weeks on each loading force，BMD，BV/TV，Tb.Th，Tb.N，Tb.Pf，SMI，Po all resulted in significant difference（P＜0.05）.Compared 10 N group with 5 N group，15 N group and control group at 4 weeks or 8 weeks，BMD，BV/TV，Tb.Th，Tb.N，Tb.Pf，SMI，Po all resulted in significant difference（P＜0.05）.Compared 15 N group with 5 N group，10 N group and control group at 8 weeks，BMD，BV/TV，Tb.Th，Tb.N，Tb.Pf，SMI，Po all resulted in significant difference（P＜0.05）.ConclusionThe analysis of bone trabecula on implant-bone interface worked by Micro CT could assess the osseointegration of different loading force and loading period more objectively，which provides theoretical foundation for immediate implanting and immediate loading.

Micro CT；immediate implanting；immediate loading；implant-bone interface；osseointegration

R 783.4；R 318.01；R 364.3

A

1000－1492（2014）04－0455－05

2014－01－25接收

2012年度南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新課題項目面上A類（編號：12MA040）

安徽醫(yī)科大學解放軍八一臨床學院（中國人民解放軍第八一醫(yī)院）口腔科，南京 210002

張亨國，男，碩士研究生；劉向輝，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：njbyliuxh864234＠sina.com