張 磊，劉家傳，楊艷艷，王金標，張永明，張 星，王春琳，黃振山

缺氧預處理對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織HIF-1α、VEGF表達的影響

張 磊，劉家傳，楊艷艷，王金標，張永明，張 星，王春琳，黃振山

目的研究缺氧預處理（HPC）對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠挫傷周圍腦組織缺氧誘導因子（HIF-1α）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響，探討缺氧預處理對創(chuàng)傷性腦損傷保護機制。方法Sprague-Dawley大鼠102只，隨機分為對照組（Con組，n＝6）、創(chuàng)傷組（TBI組，n＝48）和HPC組（n＝48）。HPC組大鼠首先置于低壓氧艙中進行HPC（50.47 kPa，3 d，3h/d），隨后HPC組和TBI組分別采用改良自由落體打擊建立大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型。顱腦創(chuàng)傷后1、4、8、12h和1、3、7、14 d，分別采用RT-PCR和Western blot法檢測各個時間點挫傷周圍腦組織HIF-1α、VEGF表達變化。結(jié)果TBI組與Con組比較，HIF-1α表達在傷后4、8、12h和1、3 d均明顯上升（P＜0.05）；VEGF表達在傷后4、8、12h和1、3、7 d均明顯上升（P＜0.05）。HPC組與TBI組比較，HIF-1α和VEGF表達在傷后1h逐漸上升，傷后4、8、12h和1、3 d顯著上升，直至傷后7 d（P＜0.05）。結(jié)論HPC可提高創(chuàng)傷性腦損傷對缺氧耐受性，誘導血管內(nèi)皮細胞功能活化，發(fā)揮早期腦保護，其機制可能涉及HPC在創(chuàng)傷性腦損傷早期促進HIF-1α、VEGF高表達。

缺氧預處理；顱腦損傷；HIF-1α；VEGF；大鼠；腦組織

缺氧預處理（hypoxic preconditioning，HPC）是指預先給予機體短時間的重復輕程度的缺氧，能夠顯著提高機體對隨后嚴重缺血缺氧的耐受力，為機體提供有效神經(jīng)保護［1－2］。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是依賴氧濃度調(diào)節(jié)主要因子，對周圍氧環(huán)境具有較強敏感性。研究［3－4］表明HIF-1α能通過對應靶蛋白調(diào)節(jié)產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是HIF-1α下游編碼靶蛋白，可參與神經(jīng)血管重塑而達到腦保護作用［5］。目前關于HPC在創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)保護作用機制尚不完全清楚。該研究通過檢測HPC后創(chuàng)傷性腦損傷腦組織中HIF-1α、VEGF表達變化，探討HPC對創(chuàng)傷性腦損傷的腦保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物102只健康清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，8～10周齡，體重250～300 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器兔抗HIF-1α單克隆抗體（貨號：ab51608）、鼠抗VEGF單克隆抗體（貨號：ab1316）購自英國Abcam公司；TRIzol Reagent（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ThermoFish公司）；GAPDH引物合成（上海生工生物工程技術服務公司）；低壓氧艙（上海減壓器廠）；ZH-ZYQ型自由落體腦損傷模型打擊器（淮北正華生物儀器設備有限公司）；筆式小型磨鉆（韓國世新精密公司）；VN-180型活塞式無油真空泵（昆山佑誠至信電機設備有限公司）；DYY-11型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 動物分組采用隨機數(shù)字法分成對照組（Con組，n＝6）、創(chuàng)傷組（TBI組，n＝48）、HPC組（n＝48），TBI組和HPC組按取材時間點不同又隨機分為傷后1、4、8、12h和1、3、7、14 d，每亞組6只。實驗中所涉及實驗動物的飼養(yǎng)和實驗方案均獲得安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的批準，并經(jīng)過相關培訓后進行。

1.4 制備低壓缺氧、創(chuàng)傷性腦損傷模型和取材低壓艙由真空泵和密閉容器組成，通過真空泵持續(xù)抽吸維持密閉容器內(nèi)的低壓力以模擬低壓低氧條件，負壓大小由進氣孔口徑大小調(diào)節(jié)，并換算成海拔高度5 500 m大氣壓（50.47 kPa，艙內(nèi)溫度保持18～25℃），處置3 d，每天3h。經(jīng)過低壓艙預處理后的大鼠給予10%水合氯醛（500 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，固定于腦立體定向儀，常規(guī)消毒后沿正中線切開頭皮，鈍性分離軟組織、骨膜，暴露顱骨，在前囟后3.0 mm，矢狀縫向右旁開3.0 mm處用磨鉆鉆穿顱骨，形成直徑約5 mm骨窗，保持硬膜完整。采用改良Feeney自由落體打擊法［6］建立大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，以打擊重量50 g砝碼離骨窗面約25 cm高處下落打擊，打擊后給予縫合頭皮。蘇醒后大鼠分籠飼養(yǎng)。在相應時間點處死大鼠，斷頭取腦切取距挫傷區(qū)邊緣0.5 cm皮層腦組織100～150 mg。

1.5 RT-PCR熒光定量檢測HIF-1α及VEGF mRNA的表達取挫傷區(qū)周圍腦組織100 mg，加入1 ml TRIzol，使用組織勻漿器在冰上進行勻漿，提取總RNA后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增反應。引物序列：HIF-1α上游：5′-AGAGTCAAGCCCAGAGTCAC-3′，下游：5′-TGGGACTGTTAGGCTCAGGT-3′，產(chǎn)物長度為116 bp；VEGF上游：5′-CGGTTCCAGAAGGGAGAGGA-3′，下游：5′-CTGGGACCACTTGGCATGG-3′，產(chǎn)物長度為188bp；GADPH上游：5′-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3′，下游：5′-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3′，產(chǎn)物長度為107 bp。擴增條件如下：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。采用2－ΔΔCT表示各樣本目的基因mRNA的相對表達量，并作為最終數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.6 Western blot法檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達取挫傷區(qū)周圍皮層腦組織約100 mg，加入RIPA細胞裂解液100 μl（含1 μl PMSF）進行裂解，并進行組織勻漿，提取總蛋白，測定蛋白含量，進行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉2h、滴加一抗、二抗進行免疫反應，化學發(fā)光、顯影、定影，最后拍照。采用Quantity one灰度軟件進行分析，以HIF-1α、VEGF蛋白與β-actin的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α及VEGF mRNA水平相對表達量HIF-1α mRNA在正常腦組織中表達量相對較少，傷后4h出現(xiàn)表達上調(diào)，12h出現(xiàn)峰值，3 d開始下調(diào)（P＜0.05），傷后1h和7、14 d與Con組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HPC組與TBI組比較，HIF-1α mRNA傷后1、4、8、12h和1、3、7 d表達顯著上調(diào)（P＜0.05），傷后14 d差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。VEGF mRNA在正常腦組織中表達量相對較少，傷后4h出現(xiàn)表達上調(diào)，1 d出現(xiàn)峰值，直至7 d開始表達下調(diào)（P＜0.05），傷后1h、14 d與Con組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HPC組與TBI組比較，VEGF mRNA傷后1h表達上調(diào)，以12h和1 d維持高表達，直至7 d表達下降（P＜0.05），傷后14 d差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 HIF-1α及VEGF蛋白表達變化HIF-1α蛋白在正常腦組織中相對表達量為（0.255±0.019），傷后4h HIF-1α出現(xiàn)表達上調(diào)，1 d達到峰值，直至3 d開始下調(diào)（P＜0.05），傷后1h和7、14 d與Con組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HPC組與TBI組比較，HIF-1α傷后1h即表達上調(diào)，在12h和1、3 d維持高表達，直至7 d表達下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05），傷后14 d差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。VEGF蛋白在正常腦組織中相對表達量為（0.245±0.017），傷后4h VEGF出現(xiàn)表達上調(diào)，3 d出現(xiàn)峰值，直至7 d開始下調(diào)（P＜0.05），傷后1h、14 d與Con組比較差異無統(tǒng)計學意義。HPC組與TBI組比較，HPC組VEGF傷后1h表達上調(diào)，以12h和1、3 d維持高表達（P＜0.01），直至7 d表達下調(diào)（P＜0.05），傷后14 d差異無統(tǒng)計學意義。見表1、圖2。

圖1 大鼠創(chuàng)傷后不同時間點HIF-1α及VEGF mRNA表達

圖2 創(chuàng)傷性腦損傷大鼠各時間點HIF-1α、VEGF蛋白表達

3 討論

顱腦創(chuàng)傷后局部腦組織繼發(fā)性的缺血缺氧是導致腦損害主要因素［7］。腦創(chuàng)傷后挫傷中心的神經(jīng)細胞呈不可逆損傷狀態(tài)，而挫傷周圍的神經(jīng)細胞在一定條件下有逆轉(zhuǎn)趨勢，因此創(chuàng)傷性腦損傷挫傷周圍腦組織保護是顱腦損傷救治核心。有研究［1］報道HPC可減輕缺血缺氧對神經(jīng)細胞損傷，并顯示氧含量5.5%HPC 3h將降低缺血缺氧對皮層、海馬及紋狀體神經(jīng)細胞損傷。該課題組在研究顱腦損傷后早期行高壓氧治療具有腦保護［8－9］基礎上，將深入探討HPC對顱腦損傷神經(jīng)保護作用及其機制。該研究在平原地區(qū)利用低壓氧艙模擬海拔5 500 m高原（大氣50.47 kPa）處置3h，連續(xù)3 d，后續(xù)給予自由落體致傷。結(jié)果顯示HPC組HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白傷后1h提前表達并明顯上調(diào)，在4h～7 d維持高表達，提示該條件下HPC可早期促進腦組織HIF-1α、VEGF上調(diào)并維持高表達，有效促進挫傷區(qū)血管內(nèi)皮細胞功能恢復，減輕缺血缺氧對神經(jīng)細胞損傷，進而達到腦保護作用。

表1 大鼠創(chuàng)傷后腦組織HIF-1α、VEGF蛋白表達情況（n＝6，±s）

表1 大鼠創(chuàng)傷后腦組織HIF-1α、VEGF蛋白表達情況（n＝6，±s）

與Con組比較：#P＜0.05；與TBI組比較：**P＜0.01，*P＜0.05

項目HIF-1α蛋白相對表達量TBI組HPC組VEGF 蛋白相對表達量TBI組HPC組傷后1h0.294±0.0320.333±0.024#*0.256±0.0230.305±0.028#*傷后4h0.433±0.037#0.518±0.030#**0.346±0.033#0.409±0.033#*傷后8h0.575±0.041#0.658±0.046#*0.435±0.032#0.553±0.029#**傷后12h0.679±0.047#0.802±0.066#**0.537±0.034#0.652±0.048#**傷后1 d0.752±0.058#0.992±0.056#**0.654±0.059#0.752±0.054#**傷后3 d0.589±0.027#0.779±0.048#**0.743±0.047#0.882±0.066#**傷后7 d0.293±0.0310.442±0.029#**0.428±0.034#0.488±0.039#**傷后14 d0.268±0.0340.279±0.0340.257±0.0240.263±0.036

本研究顯示，Con組中HIF-1α表達較弱。在顱腦損傷4h，挫傷周圍腦組織HIF-1α mRNA及蛋白表達逐漸上調(diào)，提示缺血缺氧是觸發(fā)HIF-1α主要誘因。與TBI組比較，HPC組HIF-1α mRNA及蛋白在傷后1h提前表達上調(diào)，并在4h～7 d持續(xù)高表達，提示HPC可早期激活HIF-1α mRNA及蛋白并維持高表達。HIF-1α高表達可能是因為在常氧條件下，HIF-1α通過泛素－蛋白酶體途徑迅速降解，但HPC造成低氧環(huán)境可抑制降解酶體系，進而導致HIF-1α降解受到抑制，促進與HIF-1β形成二聚體，在細胞內(nèi)聚集；其次可能因為顱腦損傷后缺血灶及周圍水腫帶引起占位效應，引起腦微血管調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，局部血流下降，從而導致不同程度缺血缺氧，進一步觸發(fā)HIF-1α在腦組織蓄積。在7～14 d時，HIF-1α mRNA及蛋白表達下調(diào)，可能因為后期挫傷區(qū)受損神經(jīng)細胞對缺血缺氧敏感性降低。實驗結(jié)果表明HPC可促進顱腦損傷挫傷周圍腦組織HIF-1α早期上調(diào)并維持高表達，進而加強神經(jīng)細胞對缺氧耐受性。

HIF-1α是顱腦損傷后缺血缺氧環(huán)境激活的關鍵性轉(zhuǎn)錄因子［10］，其靶蛋白VEGF可參與神經(jīng)保護［2－3］。在缺氧條件下，HIF-1α結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點上游HRE區(qū)域調(diào)控著VEGF轉(zhuǎn)錄、表達，其表達的VEGF作為一種內(nèi)源性多效性生長因子，參與腦缺血中神經(jīng)血管重塑，促進血管形成及神經(jīng)細胞保護［11－12］。本研究顯示TBI組VEGF mRNA及蛋白在4h出現(xiàn)表達上調(diào)，3 d達到峰值，7 d表達下調(diào)。此過程VEGF蛋白表達變化與劉科等［13］采用聚焦定量分析VEGF蛋白表達變化基本一致。HPC組VEGF mRNA及蛋白在傷后1h提前出現(xiàn)表達上調(diào)，以1、3、7 d維持高表達水平。因此，HPC早期可能激活VEGF基因序列并維持高表達水平，并有效活化血管內(nèi)皮細胞功能。HPC VEGF高表達可能是HPC預先誘導腦組織HIF-1α蓄積，同時激發(fā)著VEGF低氧反應結(jié)構(gòu)域HRE；再者因顱腦損傷缺血缺氧環(huán)境誘導HIF-1α上調(diào)，這些因素共同促進HIF-1α與VEGF結(jié)構(gòu)域低氧反應原件HRE結(jié)合，加快VEGF轉(zhuǎn)錄、翻譯到表達過程。VEGF表達上調(diào)將減輕神經(jīng)細胞DNA雙鏈損傷［14］，促進腦組織修復過程；加快腦組織挫傷區(qū)新血管形成及微環(huán)境構(gòu)建［5］，為挫傷周圍腦組織提供氧糖供應。實驗結(jié)果表明HPC可早期促進血管內(nèi)皮細胞活化，改善缺血缺氧對神經(jīng)細胞損傷。

總之，HPC可早期促進顱腦損傷大鼠挫傷周圍腦組織HIF-1α、VEGF激活并維持二者高表達，其機制可能是通過重復性、短暫性HPC提高腦組織對缺氧耐受能力及血管內(nèi)皮細胞功能活化。因此，本研究將為進入高原前在內(nèi)陸進行缺氧預適應訓練提供理論基礎。目前HPC在顱腦損傷神經(jīng)保護尚缺乏多方面詮釋，現(xiàn)有的實驗尚不能完全體現(xiàn)HPC對神經(jīng)細胞作用，進一步的深入研究正在進行中。

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Effect ofhypoxia preconditioning on the changes of HIF-1α and VEGF in the brain tissue in rats with traumatic brain injury

Zhang Lei，Liu Jiachuan，Yang Yanyan，et al
（Dept of Neurosurgery，The Clinical College of PLA Affiliated Anhui Medical University，The 105th Hospital of PLA，Hefei 230031）

ObjectiveTo observehypoxic preconditioning on traumatic brain injury（TBI）in rat brain tissue of contusion area ofhypoxia inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor expression affect，and to investigatehypoxic preconditioning on brain injury protection mechanism.Methods102 SD rats were randomly divided into control group（Con，n＝6），traumatic brain injury group（TBI，n＝48）andhypoxic preconditioning group（HPC，n＝48）.HPC group of rats were firstly placed in ahypobaric chamber forhypoxic preconditioning（50.47 kPa，3 d，3h/d）.Subsequently HPC group and TBI group were established rat model of traumatic brain injury by adopting improved feeney free fall.RT-PCR and Western blot were used to detect the changes of HIF-1α and VEGF in each group of brain of contusion area on the 1，4，8，12h and 1，3，7，14 d after injury.ResultsCompared with the control group，the expressions of HIF-1α in the TBI group significantly increased at 4，8，12h and 1，3 d（P＜0.05）.At the same time，the expressions of VEGF in the TBI group werehigher than those in the control group 4，8，12h and 1，3，7 d after injury（P＜0.05）.Compared with TBI group，the expression levels of HIF-1α and VEGF increased at 1h in the HPC group，and increased significantly at 4，8，12h and 1，3 d until maintained 7 d after injury（P＜0.05）.ConclusionHypoxic preconditioning can improve the traumatic brain injury ofhypoxia tolerance，induce the activation of vascular endothelial growth factor，and thus play a role of early brain protection，and its mechanism may be related to HIF-1α and VEGF expression up-regulation.

hypoxic preconditioning；traumatic brain injury；HIF-1α；VEGF；rat；brain tissue

R 651.15

A

1000－1492（2014）04－0447－05

2013－10－28接收

全軍醫(yī)學科技“十二五”科研項目（面上）（編號：CWS11J262）；2009年南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新重點課題（編號：09Z009）

安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院（中國人民解放軍第105醫(yī)院）神經(jīng)外科，合肥 230031

張 磊，男，碩士研究生；劉家傳，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：ljc571017＠sina.com