唐 偉，范曉云，陸兆雙，霍龍

多聚左旋精氨酸對NCI-H292細胞炎癥介質的調節(jié)

唐 偉，范曉云，陸兆雙，霍龍

目的研究多聚左旋精氨酸（PLA）對NCI-H292細胞分泌白細胞介素（IL）-6、IL-8、IL-13、嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）的影響。方法將NCI-H292細胞分為對照組（培養(yǎng)液）、脂多糖（LPS）組（5 μg/ml）、PLA組（Max＝40 μg/ml）、LPS＋PLA組、LPS＋PLA＋肝素組。采用ELISA法檢測各組IL-6、IL-8、IL-13、Eotaxin的水平，并比較各組間的差異。結果LPS＋PLA組IL-6、IL-8、Eotaxin的水平明顯高于對照組、LPS組、PLA組（P＜0.05），而LPS組、PLA組與對照組比較，IL-6、IL-8、Eotaxin的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組IL-13的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而肝素能夠降低LPS＋PLA組IL-6、IL-8、Eotaxin的水平（P＜0.05）。結論PLA促進LPS誘導NCI-H292細胞IL-6、IL-8、Eotaxin的表達，但肝素可抑制其表達；而PLA對IL-13的表達沒有影響。

哮喘；多聚左旋精氨酸；白細胞介素-6；白細胞介素-8；白細胞介素-13；嗜酸性粒細胞趨化因子；肝素

支氣管哮喘是一種以多種炎性細胞浸潤及氣道高反應為特征的可逆性氣道阻塞性疾?。?］，其中嗜酸性粒細胞（eosinophil，Eos）在氣道黏膜的浸潤是以哮喘為主要特征。在患者支氣管活檢組織、肺泡灌洗液和外周血中均發(fā)現(xiàn)活化的Eos，其活化后釋放的顆粒主要是嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP），而在支氣管哮喘氣道高反應性（airwayhyperresponsiveness，AHR）的病理過程中，上皮細胞起著重要作用。ECP通過改變上皮細胞功能或直接細胞毒作用而影響氣道上皮細胞，釋放多種細胞因子如：白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-13、嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）等參與AHR。作為ECP的類似物，多聚左旋精氨酸（poly-L-arginine，PLA）具有與ECP相似的生物學活性。該實驗旨在通過氣道上皮細胞來研究PLA在氣道炎癥反應中的作用以及肝素對其影響。

1 材料與方法

1.1 細胞來源上皮細胞系NCI-H292是一種人肺腺癌細胞系，屬于肺泡Ⅱ型上皮細胞，單層貼壁生長，購自美國ATCC公司。

1.2 主要試劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、PLA均購自美國Sigma公司；肝素購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司；胎牛血清、RPMI 1640購自美國Gibco公司；ELISA（IL-6、IL-8、IL-13、Eotaxin）試劑盒購自上海森雄公司。

1.3 細胞培養(yǎng)NCI-H292細胞在常規(guī)培養(yǎng)基（RPMI 1640＋10%胎牛血清＋100 U/ml青霉素＋100 μg/ml鏈霉素）中培養(yǎng)［2］，37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，當細胞長至70%～80%時開始傳代，每周傳代2次，用于后續(xù)試驗。

1.4 ELISA法檢測細胞因子IL-6、IL-8、Eotaxin、IL-13的表達準備一定量的NCI-H292細胞過夜，在加入刺激物之前，用不含血清的RPMI 1640再洗1次，以去除內源性細胞因子和排除血清的影響［3］，以不加任何刺激物的細胞作為陰性對照，依照試驗設計加入LPS（5 μg/ml）、PLA（Max＝40 μg/ml）、肝素（100 U/ml），37℃孵育20h后，收集上清液，采用ELISA法分別檢測各組IL-6、IL-8、Eotaxin、IL-13的水平。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗。

2 結果

2.1 PLA在LPS刺激后增加IL-6、IL-8的釋放一定濃度的PLA（5～20 μg/ml）明顯促進LPS誘導的NCI-H292細胞IL-6、IL-8的水平（P＜0.01）；與對照組比較，LPS組、PLA組IL-6、IL-8的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且在PLA為5 μg/ml時IL-6、IL-8的水平最高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 PLA與LPS聯(lián)合刺激NCI-H292細胞其IL-6、IL-8的水平

2.2 PLA在LPS刺激后增加Eotaxin的釋放一定濃度的PLA（5～40 μg/ml）明顯促進LPS誘導的NCI-H292細胞Eotaxin的水平（P＜0.01，P＜0.05）；與對照組比較，LPS組、PLA組Eotaxin的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且在PLA＝20 μg/ml時Eotaxin的水平最高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 PLA在LPS刺激后對IL-13的水平無影響不論有無LPS刺激，不論PLA濃度多大，各組IL-13的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 肝素降低PLA與LPS聯(lián)合刺激下IL-6、IL-8、Eotaxin的水平當LPS、PLA均為5 μg/ml時，IL-6、IL-8的表達水平出現(xiàn)高峰，一定濃度的肝素（100 U/ml）降低LPS（5 μg/ml）＋PLA（5 μg/ml）組IL-6、IL-8水平（P＜0.01），而Eotaxin的表達在PLA＝20 μg/ml時出現(xiàn)高峰，100 U/ml的肝素降低LPS（5 μg/ml）＋PLA（20 μg/ml）組Eotaxin水平（P＜0.05）。見圖4。

圖2 PLA與LPS聯(lián)合作用NCI-H292細胞其Eotaxin的水平

圖3 PLA與LPS聯(lián)合作用NCI-H292細胞其IL-13的水平

圖4 肝素降低PLA與LPS共同作用NCI-H292細胞IL6、IL-8、Eotaxin的水平

3 討論

支氣管哮喘是一種由多種細胞及細胞因子參與的慢性氣道炎癥，其發(fā)生過程是氣道炎癥、AHR、氣道重構三聯(lián)征；其發(fā)病及演變主要受控于Th2型細胞因子［4］。病理檢查顯示有大量炎癥細胞的浸潤，在此過程中，一些細胞因子起重要的促進作用，如IL-6、IL-8、IL-13、Eotaxin等促進炎癥細胞的聚集、活化和炎癥介質的釋放。在正常的情況下，其表達及分泌受機體嚴格調控，但在病理情況下會出現(xiàn)異常表達，如細胞因子表達過高，從而引起炎癥、自身免疫性疾病、超敏反應等。

IL-6是一種多活性、調節(jié)急性相反應和炎癥的重要因子，主要參與哮喘的急性發(fā)作；在血清及肺泡灌洗液中均可發(fā)現(xiàn)IL-6水平明顯升高，IL-6可反映氣道炎癥情況，作為支氣管哮喘急性發(fā)作的指標之一。IL-8又稱中性粒細胞趨化因子，能夠選擇性趨化中性粒細胞進入氣道，并誘導和增強中性粒細胞脫顆粒和殺菌作用，同時吸引Eos、淋巴細胞向炎癥部位聚集，并促使其釋放ECP等炎癥介質，參與氣道炎癥及AHR形成。該研究顯示：哮喘大鼠血清、肺泡灌洗液中IL-8水平明顯升高；用外源性抗IL-8抗體中和IL-8能抑制中性粒細胞的聚集及其介導的組織損傷。IL-13是Th2類細胞因子，主要通過STAT6信號途徑調控基因表達引起AHR［5］；但對缺乏IL-13的小鼠，IL-13對誘導AHR是必須的，同時引入外源性IL-13可直接激活引起AHR的途徑，可不需要Eos及IL-4的表達。

Eotaxin是近年發(fā)現(xiàn)的趨化因子，主要來源于氣道上皮細胞，在參與哮喘發(fā)生的眾多趨化因子中，唯有Eotaxin對Eos具有特異性趨化活性，主要促進Eos在肺內募集并使其活化，從而引起組織損傷。研究［6］顯示，在大鼠血清、肺泡灌洗液及肺組織中均發(fā)現(xiàn)Eotaxin呈高表達，在典型哮喘及咳嗽變異性哮喘患者血清中Eotaxin的濃度明顯升高，且與Eos計數(shù)呈正相關［7］。

本實驗研究顯示，在LPS的誘導下，一定濃度的PLA顯著升高NCI-H292細胞IL-6、IL-8、Eotaxin的水平，并且IL-6、IL-8在PLA為5 μg/ml時出現(xiàn)高峰；而Eotaxin水平在PLA 0～40 μg/ml之間逐漸升高，在PLA為20 μg/ml時出現(xiàn)高峰，可能與PLA聯(lián)合LPS誘導NCI-H292細胞釋放細胞因子的機制不同有關。推測PLA可促進IL-6、IL-8、Eotaxin表達，從而趨化中性粒細胞、Eos、淋巴細胞等向氣道聚集，引起氣道炎癥反應；但IL-13的水平在LPS與PLA聯(lián)合作用下未見明顯變化，推測IL-13可能不通過Eos發(fā)揮作用，可能直接作用于氣道上皮細胞或通過其他信號通路等引起AHR。

肝素作為最有效的抗凝劑之一，在體內外均能延緩或阻止血液凝固；肝素已用于治療支氣管哮喘，特別是難治性哮喘，其治療作用是改善血流動力學從而改善肺循環(huán)［8］；肝素具有陰離子電荷及黏多糖結構；而內源性肝素能夠抑制Eos向炎性區(qū)域聚集，并且使陽離子蛋白引起的組織損傷減輕。在本實驗中，肝素能夠抑制PLA在LPS誘導下IL-6、IL-8、Eotaxin釋放，肝素可能中和PLA對細胞的毒性作用，抑制PLA對細胞因子的表達。

綜上所述，PLA能夠顯著促進炎癥介質IL-6、IL-8、Eotaxin的釋放，引起或加重氣道炎癥反應，從而引起哮喘發(fā)作；而肝素能夠拮抗PLA的作用。隨著對支氣管哮喘研究的不斷深入，信號傳導對各種細胞因子、炎癥介質的調節(jié)已成為熱點研究之一［9］，而阻斷這些炎癥介質引起哮喘發(fā)作的信號通路為哮喘的治療提供了更廣闊的思路。

［1］ 齊胤良，桂淑玉，王勇生，等.哮喘大鼠模型支氣管肺組織骨橋蛋白表達的變化及其調控機制的初探［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2010，45（1）：9－12.

［2］ Fan X Y，van den Berg A，Snoek M，et al.Arginine deficiency augments inflammatory mediator production by airway epithelial cells in vitro［J］.Respir Res，2009，10：62.

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［5］ 辛 琪，李浩嫙.IL-13與氣道高反應的作用機制及研究進展［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10（17）：88－9.

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［7］ 武曉蘭，唐 偉，范曉云，等.咳嗽變異性哮喘患者Eotaxin的表達及其與肺功能的關系［J］.實用醫(yī)學雜志，2013，29（2）：199－201.

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［9］ Botero T M，Son J S，Vodopyanov D，et al.MAPK signal is required for LPS-induced VEGF in pulp stem cells［J］.J Dent Res，2010，89（3）：264－9.

Poly-L-arginine regulate inflammatory mediator production by airway epithelial cells NCI-H292 in vitro

Tang Wei，F(xiàn)an Xiaoyun，Lu Zhaoshuang，et al
（Dept of Geriatric Pulmonology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the effect of interleukin（IL）-6，IL-8，IL-13，Eotaxin epithelial cells NCI-H292 by poly-L-arginine（PLA）.MethodsNCI-H292 cells were divided into control group（culture solution），lipopolysaccharide（LPS）group（5 μg/ml），PLA group（Max＝40 μg/ml），LPS＋PLA group and LPS＋PLA＋heparin group.The expressions of IL-6，IL-8，IL-13 and Eotaxin were determined by ELISA，and compared the differences among the groups.ResultsIL-6，IL-8 and Eotaxin levels in LPS＋PLA group were significantlyhigher than other groups（P＜0.05）；but there was no statistical significance among LPS group，PLA group and the control group（P＞0.05）；and also no statistical significance on IL-13 among each group（P＞0.05）；butheparin could reduce the levels of cytokines in LPS＋PLA group（P＜0.05）.ConclusionPLA can increase the expression of IL-6，IL-8，Eotaxin in NCI-H292 cells association with LPS，butheparin can inhibit the expression of cytokines；and therehas no effect on IL-13.

asthma；poly-L-arginine；interleukin-6；interleukin-8；interleukin-13；Eotaxin；heparin

R 256.12

A

1000－1492（2014）04－0427－04

2013－12－12接收

國家自然科學基金青年科學基金（編號：81100027）；安徽省高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2011A176）；安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院博士啟動基金；安徽省人社廳第九批學術和技術帶頭人及后備人選學術科研活動資助

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年呼吸內科，合肥 230022

唐 偉，女，碩士研究生；范曉云，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：smallcloud2＠126.com