羅愛(ài)花，徐美蓉，陸立銀，胡新元，文國(guó)宏，謝奎忠

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，甘肅蘭州730070)

利用HPLC法測(cè)定不同馬鈴薯品種莖葉中的α-茄堿含量

羅愛(ài)花1*，徐美蓉2，陸立銀1，胡新元1，文國(guó)宏1，謝奎忠1

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，甘肅蘭州730070)

馬鈴薯莖葉具有較高的飼用價(jià)值，但馬鈴薯莖葉中α-茄堿（龍葵素）含量高，適口性差，不易青貯，是影響馬鈴薯莖葉利用的主要因素。研究馬鈴薯莖葉中龍葵素的含量變化可為其利用提供安全技術(shù)保障。將馬鈴薯莖葉收獲后風(fēng)干粉碎，用乙醇-乙酸法提取，高效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定混合樣品中的α-茄堿含量，研究不同馬鈴薯品種莖葉中α-茄堿含量的差異。結(jié)果表明：‘費(fèi)烏瑞它’、‘克新2號(hào)’、‘隴薯3號(hào)’、‘隴薯6號(hào)’、‘隴薯7號(hào)’5個(gè)馬鈴薯品種莖葉樣品中α-茄堿的含量分別為0.138，0.171，0.159，0.185和0.199 mg/g。莖葉中α-茄堿的含量存在基因型差異。

馬鈴薯；品種；莖葉；α-茄堿

α-茄堿（Solanine）稱龍葵素，也叫馬鈴薯素，是從馬鈴薯、西紅柿、茄子等茄科植物中發(fā)現(xiàn)的有毒的糖苷生物堿，具有抗腫瘤、抑菌、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛等多種功效[1-3]。目前對(duì)馬鈴薯塊莖中α-茄堿含量的提取以及測(cè)定已有很多不同的報(bào)道[4-6]，而對(duì)馬鈴薯莖葉、葉片中α-茄堿含量的研究報(bào)道相對(duì)較少。馬鈴薯莖葉柔嫩多汁，青貯馬鈴薯葉的營(yíng)養(yǎng)成分明顯高于許多青貯植物的莖葉，有較高的飼用價(jià)值[7,8]。但是馬鈴薯莖葉α-茄堿含量高，適口性差，含糖少，不易青貯，水分含量高，難以保存。α-茄堿是影響馬鈴薯莖葉利用的主要因素，通過(guò)研究馬鈴薯莖葉中α-茄堿的含量變化可為其利用提供安全技術(shù)保障。馬鈴薯植株中糖苷生物堿的含量根據(jù)品種及起源、生育時(shí)期、器官、栽培和貯藏條件等不同而有比較大的差異[9]。了解馬鈴薯整個(gè)植株中α-茄堿含量的高低，對(duì)馬鈴薯莖葉利用乃至生物堿開發(fā)有著極其重要的意義。

本試驗(yàn)通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化篩選HPLC分析條件，建立了快速、準(zhǔn)確分析馬鈴薯中α-茄堿的HPLC方法，為馬鈴薯中α-茄堿提取物的工業(yè)化生產(chǎn)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

以馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’、‘克新2號(hào)’、‘隴薯3號(hào)’、‘隴薯6號(hào)’、‘隴薯7號(hào)’的莖葉風(fēng)干粉碎混合樣為試驗(yàn)材料。

1.1.2 儀器

Waters 2595高效液相色譜儀（美國(guó)Waters），2487紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters）。

1.1.3 試劑

α-茄堿（標(biāo)樣，Sigma公司，純度≥99%），乙醇（AR 95%），冰醋酸（AR），甲醛（AR），乙腈（CP），氨水（AR），硫酸（AR），甲醇（CP），磷酸（AR）。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18不銹鋼柱（ODS 5 μm,4.6 mm× 25 cm）；流動(dòng)相：乙腈/磷酸二氫鉀(30∶70，V/V);流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將馬鈴薯莖稈和葉片經(jīng)風(fēng)干、粉碎混勻待用。稱取粉碎后馬鈴薯莖葉混合樣12 g，加無(wú)水乙醇/乙酸混合提取液（100∶30，V/V）攪拌10 min，70℃回流10 h后過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，用5%硫酸20 mL溶解膏狀物，超聲處理45 min后過(guò)濾，濾液用濃氨水調(diào)至pH=10，低溫離心（5 000 r/min） 15 min，棄去上清液，沉淀用l%氨水洗滌，至洗滌液澄清，將結(jié)晶狀沉淀用甲醇溶解并定容至10 mL，過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾備用。

1.3.2 α-茄堿含量測(cè)定

α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：準(zhǔn)確稱取α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)品30 mg，以甲醇溶解，分別配制成0.15、0.30、0.60、1.20、1.80、2.40和3.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，以α-茄堿的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

馬鈴薯莖葉中α-茄堿含量定性分析：在最優(yōu)色譜條件下對(duì)馬鈴薯莖葉中α-茄堿成分進(jìn)行分離。采用保留時(shí)間對(duì)照法和內(nèi)標(biāo)法確定α-茄堿的出峰時(shí)間。準(zhǔn)確稱取馬鈴薯莖葉混合樣品12 g，分別加入一定量的α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)品，以峰面積外標(biāo)法定量測(cè)定混合樣中α-茄堿的含量，5次重復(fù)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

馬鈴薯莖葉中α-茄堿定量的測(cè)定：取各提取樣品溶液10 μL進(jìn)樣，在最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定α-茄堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

在190～400 nm波段對(duì)α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，確定最大吸收峰波長(zhǎng)為208 nm。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相為乙腈/磷酸二氫鉀(30∶70，V/V)時(shí)，馬鈴薯莖葉中α-茄堿與其他峰都可得到分離。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度

以確立的最優(yōu)色譜條件進(jìn)行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線值，以α-茄堿的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：Y=7.21×105X+3.4×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999。重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=0.57%（＜1%），表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品與馬鈴薯莖葉樣品中α-茄堿的定性分析

用HPLC測(cè)定標(biāo)樣的α-茄堿，出峰時(shí)間和分離效果如圖1所示。從圖1可以看出，α-茄堿在確立的最優(yōu)色譜條件下的保留時(shí)間約4.755 min，分離較好。在確立的最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，樣品及外標(biāo)中的α-茄堿峰保留時(shí)間與α-茄堿標(biāo)樣的基本重合，分別為4.765和4.772 min，并與其他組份達(dá)到了較好的基線分離。

圖1 α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Figure 1HPLC chromatogram of α-solanine standard and sample

表1 不同馬鈴薯品種莖葉中α-茄堿含量Table 1α-Solanine content in stem and leaf mixed samples of different potato varieties

2.4 馬鈴薯莖葉中α-茄堿的HPLC法測(cè)定

將1.3.1中制備好的5種樣液在確立的最優(yōu)色譜條件下測(cè)定，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算其中的α-茄堿含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

通過(guò)乙醇/乙酸混合提取，HPLC法測(cè)定5個(gè)馬鈴薯品種莖葉混合風(fēng)干樣品中的α-茄堿含量，結(jié)果表明，5個(gè)品種中，晚熟品種‘隴薯7號(hào)’莖葉混合樣中的α-茄堿含量最高，早熟品種‘費(fèi)烏瑞它’莖葉混合樣品中的α-茄堿含量最低。統(tǒng)計(jì)分析表明，參試品種間莖葉混合樣品的α-茄堿含量存在基因型差異，且差異水平達(dá)到極顯著水平。

2.5 回收率與精密度

稱取已測(cè)定了α-茄堿含量的正常馬鈴薯莖葉提取樣品，分別加入一定質(zhì)量的α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，該試驗(yàn)回收率較高，總平均回收率為94.3%，因此檢測(cè)結(jié)果可靠。

將同一樣品取樣3次，進(jìn)樣測(cè)定α-茄堿含量，做精密度實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。5個(gè)馬鈴薯品種莖葉α-茄堿含量多次測(cè)定結(jié)果RSD＜1%，表明該方法精密度良好，測(cè)定值準(zhǔn)確可靠。

表2 馬鈴薯莖葉中α-茄堿的回收率Table 2Collection ratio of α-solanine content in potato stem and leaf

表3 試驗(yàn)結(jié)果的精密度(mg/g)Table 3Degree of precision for experimental results

3 討論

有研究表明，馬鈴薯莖葉具有較好的飼用價(jià)值，1 kg莖葉含有0.12個(gè)飼料單位，20～40 g可消化蛋白質(zhì)，80 mg胡蘿卜素，干物質(zhì)含量為18.4%，粗蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的16.2%，粗纖維占干物質(zhì)的20.8%，粗脂肪占干物質(zhì)的1.8%，鈣含量為1.39%，磷含量為0.14%[6,8]。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，會(huì)產(chǎn)生越來(lái)越多的馬鈴薯莖葉廢棄物而得不到有效利用，浪費(fèi)了資源。然而馬鈴薯莖葉中含有有毒的α-茄堿，導(dǎo)致了莖葉適口性差，加上莖葉中含糖量少，水分含量高，難于保存利用，而且不同馬鈴薯品種及其起源、生育時(shí)期、器官、栽培和貯藏條件等均對(duì)植株中糖苷生物堿的含量存在很大影響。

不同品種（系）馬鈴薯龍葵素含量不同，這和本試驗(yàn)證明馬鈴薯莖葉中龍葵素含量存在基因型差異的結(jié)果一致。同一品種的馬鈴薯若遭受機(jī)械損傷、變綠、蟲蛀、長(zhǎng)芽和局部霉變等均會(huì)導(dǎo)致龍葵素含量的增加，研究表明，受傷可使塊莖龍葵素含量高出正常塊莖16倍之多[10]。韓俊清[8]研究表明，馬鈴薯莖葉經(jīng)干制后營(yíng)養(yǎng)損失大，霉菌滋生，適口性更差。α-茄堿具有一定的光、熱穩(wěn)定性，光照會(huì)導(dǎo)致龍葵素增多，因而研究馬鈴薯莖葉中α-茄堿的含量變化可為其安全利用提供理論和技術(shù)支持。有研究表明對(duì)收獲后的馬鈴薯莖葉預(yù)干處理之后進(jìn)行生物添加劑，如乳酸菌制劑、酶制劑等處理可以改善馬鈴薯莖葉青貯飼料品質(zhì)[11-14]，這對(duì)了解馬鈴薯莖葉中α-茄堿的含量變化和合理利用豐富的馬鈴薯資源提供了技術(shù)支撐。

本課題組成員目前正在開展對(duì)不同馬鈴薯品種莖葉進(jìn)行生物制劑添加處理來(lái)研究對(duì)莖葉青貯飼料品質(zhì)的影響研究，初步發(fā)現(xiàn)對(duì)莖葉進(jìn)行預(yù)干處理后添加乳酸菌和酶制劑后青貯飼料品質(zhì)較優(yōu)，對(duì)其中α-茄堿含量的變化影響如何有待進(jìn)一步研究。

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HPLC Method for Determination of α-Solanine Content in Stem
and Leaf of Different Potato Varieties

LUO Aihua1＊,XU Meirong2,LU Liyin1,HU Xinyuan1,WEN Guohong1,XIE Kuizhong1
(1.Institute of Potato,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Institute of Agricultural Quality
Standards and Testing Technology,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China)

Stemandleafofpotatohavehighfeedingvalues,buthighcontentofα-solanineinpotatostemandleaf,which leads to poor palatability and difficulty in silage storage,is the main factor affecting utilization for potato stem and leaf. Understanding the content changes in α-solanine of stem and leaf could provide technical support for their safe use.After harvesting,stem and leaf of potato were dried and crushed,the mixed samples were extracted with ethanol acetic for α-solanine,and then high performance liquid chromatography(HPLC method)was used to determine its changes in different potatovarieties.Theresultsshowedthat theα-solaninecontentsofstemandleafin'Favorita','Kexin2','Longshu3','Longshu 6',and'Longshu7'were0.138,0.171,0.159,0.185and0.199mg/g,respectively.Theα-solaninecontentofstemsandleaves hasgenotypicdifference.

potato;variety;stem and leaf;α-solanine

S532

B

1672－3635（2014）06-0331-04

2014-09-19

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2012年青年基金（2012GAAS15-11）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2012年科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2012GAAS08）。

羅愛(ài)花（1977-），女，副研究員，主要從事馬鈴薯栽培及抗逆生理研究。

羅愛(ài)花，E-mail:florancehua@163.com。