陳文娟+謝勇平+張曉嬋+賴靜萍+金子越+方戰(zhàn)強+方展強

摘 要：采用動力學酶標熒光法，檢測了東莞市數(shù)所污水處理廠、制藥廠和電子廠廢水對食蚊魚（Gambusia affinis）肝組織中7-ethoxyresorufin o-deethylase （EROD）酶活性的影響，評價了運用EROD酶活性監(jiān)測水環(huán)境污染物的生物效應(yīng)的可行性。結(jié)果顯示，食蚊魚分別暴露于經(jīng)稀釋為20%，40%，60%，80%不同梯度的廢水液72 h后，肝臟EROD酶的活性分別與受試城市污水處理廠、制藥廠和電子廠的廢水之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系，EROD酶活性隨污水濃度的增加而提高。電子廠廢水的最大誘導(dǎo)倍數(shù)與對照組的比值可達到5.26，這表明其水體中存在的有機污染物較多，污水處理廠次之，制藥廠的出水中污染物最少。研究表明，食蚊魚肝組織EROD酶活性可以作為監(jiān)測城市廢水污染的理想生物標記物，后續(xù)的研究工作應(yīng)使之標準化。

關(guān)鍵詞：動力學酶標熒光法；城市廢水；EROD酶活性；食蚊魚

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.013

Effects of EROD Activity in Liver of Mosquitofish Exposed to Urban Wastewater

CHEN Wen-juan1，3， XIE Yong-ping1，3， ZHANG Xiao-chan1，3， LAI Jing-ping1，3， JIN Zi-yue1，3， FANG Zhan-qiang2，3， FANG Zhan-qiang1，3

（1. College of Life Science， South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510631， China； 2. School of Chemistry and Environment， South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510006， China；3. Guangdong Technology Research Center for Ecological Management and Remediation of Urban Water System， Guangzhou， Guangdong 510006， China）

Abstract： The kinetic enzyme assay method was used to measure the 7-ethoxyresorufin o-deethylase （EROD）activity in liver of mosquitofish （Gambusia affinis） exposed in enterprise wastewater from the number of sewage treatment plants， pharmaceutical plants and electronics factory of Dongguan City in order to assess the degree of pollution by persistent organic pollutants in water environment. Male mosquitofish were exposed to 20%， 40%， 60% and 80% of the different gradient dilution of wastewater for 72 h by using the hydrostatic bath method， and the EROD enzyme activities in fish liver were detected， respectively. The results showed that within a certain concentration of pollutant， there were dose-effect relationship between in EROD activity and wastewater pollutant concentration. In a certain range of pollutant concentrations， EROD activity with the increase of effluent， dose-response relationship evident. The largest electronics factory experimental group and control group induction ratio was 5.26， which indicated that the persistent organic pollutants in wastewater from the electronics plants were higher than that in sewage treatment plants and pharmaceutical plants. Reality monitoring practice confirmed that the use of EROD for water monitoring of the biological effects of environmental pollutants is feasible， but still need more detailed studies to supplement， improve， and standardize.

Key words： kinetic enzyme assay； urban wastewater； EROD activity； Gambusia affinis

持久性有機污染物如有機氯殺蟲劑、多氯聯(lián)苯（PCBs）和多環(huán)芳烴（PAHs）等，能誘導(dǎo)生物機體內(nèi)一些酶活性的提高。污染物在生物體內(nèi)進行生物轉(zhuǎn)化過程階段I和階段II的酶，包括混合功能氧化酶系（MFO）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDPGT）等。其中MFOs是污染物在體內(nèi)進行生物轉(zhuǎn)化階段I過程中的關(guān)鍵酶系[1]。MFOs系統(tǒng)主要分布于動物的肝、肺、皮膚、腎等器官組織中，肝臟是MFOs最活躍的部位。生物代謝中酶活性的變化是一種能反映環(huán)境物理和化學變化的生物標記物，可以對環(huán)境的變化提供早期預(yù)報，可以監(jiān)測環(huán)境污染狀況。7-乙氧基異吩唑酮-脫乙基酶（7-ethoxyresorufin o-deethylase，EROD）屬MFOs中的P4501A族，是第1階段代謝酶，EROD對多環(huán)芳烴（PAHs）的作用非常敏感，國外已經(jīng)將此酶用于原油污染、牛皮紙廠排放液、工業(yè)廢水和城市污水的環(huán)境評價中[2]。由于水環(huán)境中超痕量的有機污染物都對與其共存的魚體內(nèi)EROD的活性產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用，因此，該監(jiān)測指標可作為評估水環(huán)境健康狀況的早期預(yù)警指標[3]。目前國內(nèi)的研究主要集中于EROD與某些持久性有機污染物的濃度效應(yīng)關(guān)系，如多環(huán)芳烴化合物[4]、重金屬[5]、有機氯化合物[6]和二噁英類化合物[7]對魚類微粒體EROD的體內(nèi)和體外誘導(dǎo)作用。有研究發(fā)現(xiàn)EROD的活性變化與PAHs、二噁英類化合物和有機氯化合物的濃度存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其活性變化可以作為評估該類污染物的生物標志物[4，6-7]，但對如何利用生活在城市污染河涌中的食蚊魚肝組織中的EROD酶活性，進行水環(huán)境污染物的生物效應(yīng)監(jiān)測尚少研究報道。

食蚊魚（Gambusia affinis）是原產(chǎn)于北美洲的著名入侵種，屬鳉形目（Cyprinodontiformes），胎鳉科（Poeciliidae）。在我國華南地區(qū)，食蚊魚廣泛分布在淡水水體，尤其多被發(fā)現(xiàn)生活于城市河涌中，容易捕撈，易于在實驗室進行試驗，因此被廣泛用于作為生物指示種類。本研究通過室內(nèi)試驗與研究，分析暴露在東莞具代表性的數(shù)所城市污水處理廠、制藥廠和電子廠排出的廢水中生活的食蚊魚，分別檢測經(jīng)不同稀釋濃度污水暴露后的食蚊魚肝臟內(nèi)EROD活力，探討該地區(qū)水環(huán)境的污染現(xiàn)狀，為當?shù)丨h(huán)保部門提供污染治理的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

TV紫外分光光度計、96孔板、移液槍、離心管（1.5 mL）、蛋白質(zhì)檢測試劑盒、自動酶標儀等.NADPH（N-1630）7-乙氧基異吩噁唑酮（7-Ethoxyresorufin，sodium salt of resorufin；E-3763）、異吩噁唑酮（resorufin）均購自美國Sigma公司。

1.2 試驗動物和暴露設(shè)計

食蚊魚購自廣州市花地灣花鳥魚市場，對食蚊魚進行性別鑒定：雄魚平均體長20～35 mm，具有生殖鰭（第3鰭條明顯延長），且鰭上具鉤的為性成熟的雄魚個體；具有生殖鰭，但沒具鉤的為未性成熟的雄魚（幼魚）。雌魚體長17～60 mm，第3鰭條沒有延長，無胎斑（食蚊魚懷孕時腹部有一明顯的黑點，稱之為胎斑）的幼魚，及具有胎斑的為懷妊個體，屬性成熟的雌魚。試驗魚在生命科學學院生態(tài)毒理學實驗室暫養(yǎng)，隨機性地從東莞4所城市污水處理廠、4所制藥廠和3所電子廠采集廢水并分別稀釋為20%，40%，60%，80%等梯度濃度，再將等量健康、活力強的生長狀況相近的雄性食蚊魚（每試驗組12尾）暴露于上述的污水稀釋液72 h，然后分別將試驗魚處死并迅速取出肝臟樣品暫貯藏冰箱。同時設(shè)置平行實驗組。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 取肝臟樣品（30±1.5） mg，加1.5 mL預(yù)冷的勻漿液（磷酸緩沖液pH值 7.6）于勻漿機中勻漿2 min后進行冷凍離心（-4 ℃，10 000 r·min-1， 20 min），上清液分裝3份，1份用作測定EROD，1份用作測定蛋白質(zhì)，1份備用。上清液分裝后，馬上保存在4 ℃下，待分析測定。

1.3.2 EROD活性的測定 EROD活性測定參照Pohl and Fouts[8]方法稍作修改。對實驗室測定條件進行優(yōu)化：選擇pH值7.6的NaH2PO4體系作為本試驗的緩沖液；試驗中采用0.92 μmol·L-1的底物濃度；NADPH在反應(yīng)中起到還原劑和電子供體的作用，反應(yīng)方程式為：RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+， 反應(yīng)體系中NADPH的濃度為0.13 mmol·L-1；選擇22 ℃作為試驗的反應(yīng)溫度，并且在5 min中內(nèi)完成測定，以獲取活性的最大值，并在活性開始衰減前完成測定。EROD活性的測定公式：

■

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用Bradford法[9]，取300 μL離心后的酶源上清液或其稀釋液，加入96孔板的每個孔中，在A1～F1孔中加入10 μL的蛋白標準液，在A2～F2孔中加入10 μL ddH2O，在T1～T24中分別加入10 μL的樣品勻漿液，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，加入顯色劑考馬斯亮藍，在黑暗下室溫靜置5 min，接著放入酶標儀中通過測定595 nm下的吸光值來確定蛋白質(zhì)的含量。蛋白標準為小牛血清（購自上海生化試劑公司）。蛋白質(zhì)含量按以下公式計算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差分析（One Way-ANOVA）法對數(shù)據(jù)進行差異性分析。用Excel 2003做柱形圖。設(shè)置P<0.05時，表示差異顯著；當P<0.01時，表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋濃度廢水暴露肝臟EROD活性的變化

食蚊魚暴露于不同稀釋濃度的企業(yè)廢水中72 h后其肝臟EROD活性的變化結(jié)果見表1，東莞3所電子廠的最大誘導(dǎo)倍數(shù)與對照組的比值達到5.26，表明其水體中存在的持久性有機污染物較多，而4所污水處理廠次之，4所制藥廠的出水中污染物則最少。

可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，EROD酶的活性值與受試點稀釋廢水濃度之間存在著劑量效應(yīng)關(guān)系。在一定的濃度范圍內(nèi)，EROD酶的活性隨著廢水濃度的升高而增加，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。而當廢水濃度升高時，EROD酶的活性則大幅下降。上述結(jié)果說明魚體中EROD活性對水環(huán)境中特定有機污染物具有較好的指示作用。

如圖1所示，本次試驗隨機取樣的4所城市污水處理廠中，污水處理廠1、污水處理廠3和污水處理廠4出水口廢水的稀釋濃度在20%到40%之間，受暴露的食蚊魚肝臟EROD酶的活性隨著升高，而暴露在40%到80%的濃度時，其EROD酶的活性則逐漸降低；食蚊魚暴露在污水處理廠2出水口廢水的稀釋濃度在20%到40%之間時，EROD酶的活性也隨著升高，所不同的是，隨著濃度的再進一步升高，EROD酶的活性則隨之先下降后再上升，其最高誘導(dǎo)倍數(shù)是對照組的2.09倍（表1），與其他3個污水處理廠相比差異顯著（P<0.05）。

如圖2所示，受試的制藥廠1、制藥廠2、制藥廠3和制藥廠4等4所制藥廠出水口采集的廢水樣品經(jīng)稀釋為20%，40%，60%，80%的濃度，對食蚊魚肝臟EROD活性所測得的最高誘導(dǎo)倍數(shù)相對于污水處理廠的較低，分別為1.36，1.06，1.24，1.01，

基本接近對照組的水平（表1）。其中制藥廠3采樣點測得的食蚊魚肝臟EROD酶的活性與對照組相比有極顯著差異（P<0.01）。

如圖3所示，受試的電子廠1、電子廠2和電子廠3所采集的廢水樣品稀釋為20%，40%，60%的濃度，當食蚊魚暴露在電子廠2和電子廠3樣品40%和60%的濃度時，所測得的最高誘導(dǎo)倍數(shù)達到5.26和5.03之多（表1），與對照組相比均存在極顯著差異（P<0.01）。

2.2 不同企業(yè)排放廢水暴露肝臟EROD活性的變化

本試驗比較了食蚊魚暴露于污水處理廠、制藥廠和電子廠不同企業(yè)所排出廢水（同一濃度）中72 h后對其肝臟EROD活性影響的結(jié)果。

如圖4所示，經(jīng)電子廠廢水暴露后所測得的食蚊魚肝臟EROD活性最高，其次是污水處理廠，最低的則為制藥廠。其中食蚊魚暴露于同一濃度的電子廠廢水中，測得其肝臟EROD活性相對于污水處理廠和制藥廠廢水的要高得多，如濃度為20%時，電子廠2和電子廠3廢水所暴露的EROD活性達到0.844，0.599 pmol·（min-1·mg-1），與對照組的比值達到5.26，5.03（表1），而污水處理廠和制藥廠在該濃度所測得的肝臟EROD活性最高也只達到0.417，0.237 pmol·（min-1·mg-1）。在濃度為60%時，電子廠2和電子廠3廢水所暴露的EROD活性達到1.051，1.005 pmol·（min-1·mg-1），而污水處理廠和制藥廠在該濃度所測得的肝臟EROD活性最高也只達到0.371和0.278 pmol·（min-1·mg-1）。

EROD酶屬MFO中的PA501A族，是評價有機污染物生物毒性的敏感酶學指標。肝臟細胞色素氧化酶P450系統(tǒng)（CYP450）的主要作用是催化外源性化合物的代謝，增加底物的親水性和極性，促進排泄。因此許多潛在致毒、致突變、致癌化合物（如多環(huán)芳烴PAH、多氯聯(lián)苯PCB等持久性有機物）都能夠誘導(dǎo)EROD的活性，而且其活性增加的程度與共存環(huán)境中特定污染物的濃度存在著顯著的劑量-效應(yīng)相應(yīng)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，電子廠廢水中存在的持久性有機污染物較多，污水處理廠次之，制藥廠的則最少。

3 結(jié)論與討論

3.1 食蚊魚暴露于同一企業(yè)的不同濃度的廢水中肝臟EROD活性的變化

本試驗結(jié)果顯示，不同廢水濃度對EROD活性的影響，大體表現(xiàn)為低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制。已有文獻報道多環(huán)芳烴化合物可誘導(dǎo)EROD酶的活性，使其活性升高，且EROD活性的升高與PAHs的濃度存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[10]，如在苯并[a]芘（BaP）濃度達到0.022 μmol·L-1時酶活性達到最大，隨著濃度的升高，酶的活性反而迅速下降。王菊英等[10]于2003年研究了多氯聯(lián)苯PCB-28對牙鲆肝臟中EROD活性的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)即使是加標濃度最低的5 μg·dm-3濃度組，其EROD活性也達到了對照組的1.7倍，加標量為30 μg·dm-3時，EROD的活性比對照組高出1.5倍。徐盈等[11]在利用EROD生物測試法快速篩選采集于湖北省鴨兒湖地區(qū)環(huán)境樣品二噁英類化合物的研究中發(fā)現(xiàn)，EROD生物測試法具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，適合于對環(huán)境樣品中的二噁英類化合物進行快速定量篩選，而HRGC/HRMS-MID對生物測試所獲得的數(shù)據(jù)也進行了進一步確認。已有報道利用淡水貽貝（Dreissena polymorpha）的EROD酶活性的升高和AChE（乙酰膽堿酯酶）酶活性的抑制作為生物標志物，調(diào)查意大利被POPs污染的sTb-alpine great lakes 的17個位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與參照點Lake LTgano相比具有顯著性升高[12]。這些研究結(jié)果與本試驗結(jié)果相一致，分析所取的不同企業(yè)廢水都有不同程度的污染，存在一定量的持久性有機污染物，這些有機污染物誘導(dǎo)了食蚊魚肝臟中混合功能氧化酶的代謝，導(dǎo)致EROD的活性升高。由于EROD活性受特定污染物的誘導(dǎo)是相當顯著的，因此可以在生物體尚未受到嚴重傷害或未發(fā)生生物積累時就可指示出特定污染物的存在。上述結(jié)果既體現(xiàn)了EROD活性對持久性有機物的指示作用，也較好地體現(xiàn)了EROD活性具有早期預(yù)警功能。

從食蚊魚暴露于不同濃度的同一企業(yè)廢水中后其肝臟EROD活性的變化圖形來看，大多為“鐘形（bell）”曲線，這種曲線在PCBs或PAHs對EROD誘導(dǎo)的體內(nèi)、體外實驗都已經(jīng)有過報道。研究結(jié)果顯示，開始時酶活性隨著毒物的濃度升高而增大，但增大到一定程度時反隨著濃度的增高而降低。這種反應(yīng)是脊椎動物包括哺乳動物、鳥類、魚類的普遍反應(yīng)[13]。我們認為引起這種現(xiàn)象的原因可能是當受試魚肝臟EROD酶受到污水中有機污染物誘導(dǎo)時，其活力迅速增加，但當接觸更高濃度的刺激時EROD酶活力反而降低。隨著有機污染物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的富集，肝細胞中的酶系統(tǒng)因受毒性影響而失活，這也可能與脂質(zhì)過氧化有關(guān)。有些有機污染物如BaP在活化代謝過程中可生成20余種代謝物，均有不同程度的脂質(zhì)過氧化作用，可導(dǎo)致CYP1A1的組裝或構(gòu)型的改變，從而降低EROD酶活力水平[14]。而本試驗從污水處理廠2廢水得出的結(jié)果卻顯示，受試魚在暴露期間其肝臟EROD的活性出現(xiàn)了先升高后降低再升高的變化趨勢，最后再升高的原因可能是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基被及時清除，沒有對肝臟造成嚴重的損傷，另一方面也可能與食蚊魚自身的防御系統(tǒng)和污水中存在的有機污染物的代謝產(chǎn)物有關(guān)，如BaP等持久性有機污染物進入魚體后產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物，但究竟是哪一種或是哪幾種代謝產(chǎn)物？其主要作用是什么？這還有待進一步研究。

3.2 生物體內(nèi)活性與環(huán)境中特定污染物濃度的定量響應(yīng)關(guān)系

就污染物的生物效應(yīng)監(jiān)測技術(shù)而言，研究受試生物體內(nèi)EROD活性的最終目的，是建立生物體內(nèi)EROD活性與環(huán)境中特定污染物濃度的定量響應(yīng)關(guān)系。但是應(yīng)當指出，在自然環(huán)境中，影響生物體內(nèi)EROD活性的因素是多種多樣的，如環(huán)境溫度、鹽度，生物自身的體長、年齡和性別，是否處于排卵期，受試生物體內(nèi)各組織器官對污染物的敏感程度、季節(jié)變化和時空變化，尤其是多種污染物共存時其毒性的加合、協(xié)同抑或拮抗等，都是不可預(yù)知的。因此建立生物體內(nèi)EROD活性與環(huán)境中特定污染物濃度的定量響應(yīng)關(guān)系難度相當大。到目前為止，只能通過具體實例來分析環(huán)境中某些特定污染物對目標生物體內(nèi)EROD活性的誘導(dǎo)作用。在研究紅鯔魚（Limanda limanda）體內(nèi)的EROD活性后發(fā)現(xiàn)，魚肝內(nèi)多氯聯(lián)苯PCB-28的濃度與EROD活性存在著良好的正相關(guān)關(guān)系，尤其是PCB-28（R=0.991）與試驗結(jié)果幾乎是一致的；在農(nóng)藥類污染物中林丹與其具有一定的正相關(guān)性；痕量金屬與EROD活性基本上不具有明顯的相關(guān)性[15]。本研究結(jié)果則顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，EROD酶的活性值與受試工廠廢水濃度之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系，EROD的活性隨著污水濃度的升高而增加，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯，這表明魚體中EROD活性對水環(huán)境中特定有機污染物具有較好的指示作用。

由于EROD活性受到諸多因素的影響，在很多的現(xiàn)場研究中EROD活性和化學法測定的數(shù)據(jù)也不相一致。如對英國鮭魚的現(xiàn)場研究表明，CYP1A1蛋白水平和EROD活性都異常高，但與分析化學所測得的PAHs和PCBs含量的數(shù)據(jù)不相一致[16]。對暴露于地中海法國沿岸的PAHs和sea comber（Serranus cabrilla）魚肝EROD活性分析，二者沒有很好的相關(guān)性[17]。因此，很多學者認為，通過單純地分析EROD活性來檢測環(huán)境中的有機污染物是不夠的。運用生物效應(yīng)指標對水環(huán)境的污染狀況進行評價時，若單獨使用某一種生化指標很可能會導(dǎo)致評價結(jié)果與現(xiàn)場實際污染狀況的偏離，但如果能在同一評價區(qū)域同時使用幾種不同的生化指標，并結(jié)合生理學及化學測定數(shù)據(jù)，其評價結(jié)果可能會如實地反映現(xiàn)場的真實污染狀況。許多現(xiàn)場監(jiān)測實踐證實：運用EROD進行水環(huán)境污染物的生物效應(yīng)監(jiān)測是切實可行的，但仍需進行更為詳盡的研究以補充、完善，并使之標準化。鑒于此，大量的研究工作還有待于今后進行。

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