劉洋

摘 要：根據(jù)山葡萄的CBF1基因序列設(shè)計(jì)一對特異引物，克隆出山葡萄（Vitis amurensis）栽培品種 ‘雙優(yōu)的抗寒轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因，并將其構(gòu)建到pBI121表達(dá)載體中，獲得山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的植物表達(dá)載體，命名為pBI121-ViCBF1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化‘巨峰葡萄以研究高效的‘巨峰葡萄轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，以農(nóng)桿菌LBA4404為介導(dǎo)菌株，以‘巨峰葡萄葉片為外植體、3 d為預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和4～5 d共培養(yǎng)時(shí)間、400 mg·L-1羧芐青霉素，50 mg·L-1卡那霉素篩選濃度轉(zhuǎn)化效果較好，并已篩選到6株轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測均為陽性，為提高‘巨峰葡萄的抗寒性建立了初步的技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：山葡萄；表達(dá)載體；轉(zhuǎn)錄因子；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.002

Cloning of Transcription Factor CBF1 of Vitis amurensis and Its System of Genetic Transformation

LIU Yang

（Changchun Vocational University， Changchun， Jilin 130033，China）

Abstract： Designing a pair of single primer by CBF1 gene of Vitis amurensis，cloning transcription factor CBF1 gene of Vitis amurensis， the vector of pBI121-ViCBF1 was constructed and transformed to Vitis labruscana Kyoho by agrobacterium-mediated method. The regenerated resistant plants could be obtained by pre-culturing for 3 d， coculturing with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for 4～5 d， and then transferred to the callus inducement media containing 400 mg·L-1 Carb and 50 mg·L-1 Kan for 28 d. Under this construction， the rate of plant transformation was relatively higher and six putative transgenic plants had gotten， product of PCR was positive， the system was an elementary technology for increasing cold resistance of Vitis labruscana Kyoho.

Key words： Vitis amurensis； expression vector； transcription factor； genetic transformation

當(dāng)前，隨著農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，低溫、干旱及高鹽嚴(yán)重威脅著現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展。我國東北和西北兩地農(nóng)作物凍害發(fā)生普遍，因凍害所造成的損失也十分嚴(yán)重。我國東北山葡萄抗寒性最強(qiáng)（耐-40 ℃低溫），在山葡萄中發(fā)現(xiàn)的CBF 低溫反應(yīng)途徑是，通過CBF 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控大量下游有CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）調(diào)控元件的COR（cold-regulated）基因的表達(dá)，來提高植物的抗凍力[1-2]。據(jù)報(bào)道，大量表達(dá)擬南芥CBF1基因的轉(zhuǎn)基因植物，其抗寒性平均提高了10.8 ℃[3]。因此，大量表達(dá)抗寒功能更強(qiáng)的山葡萄CBF1基因的‘巨峰葡萄，其抗寒能力很可能強(qiáng)于轉(zhuǎn)擬南芥CBF1基因的植株，這種轉(zhuǎn)基因‘巨峰葡萄將能在東北乃至更寒冷的地區(qū)露地安全越冬，從而改變傳統(tǒng)的“埋土防寒”措施，減少作物因低溫天氣造成的減產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 材 料

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）栽培品種‘雙優(yōu)、‘巨峰葡萄（Vitis labruscana Kyoho）、大腸桿菌E.coli DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)質(zhì)粒pBI121均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供?？寺≥d體為pGEM-T easy vector購自寶生物工程（大連）有限公司。TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶購自上海生工生物工程公司。DNA提取試劑盒、及切膠回收試劑盒均購自寶泰克公司。

1.2 山葡萄CBF1基因的克隆

根據(jù)已知的山葡萄CBF1基因序列設(shè)計(jì)引物，在其上游、下游分別引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物：5′-CCATCTAGACCATGGACTCGGACCACGAAG-3′，下游引物：5′-TGAGCTCTTAATCATCATTCCACAAAGACAAGTC-3′。引物由Takara（大連）公司合成。

提取山葡萄的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，并以此為模版PCR擴(kuò)增后獲得CBF1基因的編碼序列，連接在pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定，最后進(jìn)行測序。

逆轉(zhuǎn)錄體系為：取mRNA5 μL（≤2 μg），反轉(zhuǎn)錄酶4 μL，buffer（5×）4 μL，dNTP （10 mmol·L-1）2 μL，RNase Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，DEPC水3.5 μL，70 ℃水浴變性5 min，冰浴5 min稍離心，慢慢混勻后，低速離心，收集液滴，42 ℃溫浴60 min，85 ℃加熱10 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA。

PCR反應(yīng)體系：以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL的體系包括0.5 μL cDNA，2 μL buffer（10×），2 μL Mg2+（25 mmol·L-1），0.25 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.5 μL P1，0.5 μL P2，0.25 μL Taq酶（5 U·μL-1），14 μL ddH2O，擴(kuò)增引物見表1，擴(kuò)增程序?yàn)橄拢?4 ℃預(yù)變性6 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃60 s，72 ℃延伸8 min。4 ℃保存。循環(huán)后72 ℃保溫延伸10 min。

1.3 植物表達(dá)載體pBI121-ViCBF1的構(gòu)建

用XbaⅠ和SacⅠ分別酶切目的基因和質(zhì)粒載體，目的DNA 片段回收后用T4 連接酶連接，并將此重組體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 mg·L-1Amp 的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，挑取白斑用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，得到植物表達(dá)載體pBI121-ViCBF1。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

農(nóng)桿菌液侵染外植體和與其共培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化前1 d，將已轉(zhuǎn)化了植物表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液接種于YEP液體培養(yǎng)基上（含利福平30 mg·L-1、卡那霉素50 mg·L-1），27 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)過夜， 4 ℃4 000 r·min-1離心5 min，取沉淀用無菌的MS液體培養(yǎng)基稀釋，測定OD600值分別為0.2，0.4，0.6，0.8時(shí)取出使用。取切好的葉片，分別在愈傷組織誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1，2，3，4，5 d。后將預(yù)培養(yǎng)后的外植體放入農(nóng)桿菌菌液中7～10 min，取出后用無菌紗布吸干外植體表面殘留的菌液，然后接種于放入不含任何抗生素的愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25 ℃暗室共培養(yǎng)3，4，5，6 d，待葉片在培養(yǎng)基接觸處長出肉眼可見菌落時(shí)，轉(zhuǎn)入含有卡那霉素（20，30，40，50 mg·L-1）和羧芐青霉素（300，400，500，600 mg·L-1）的愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化培養(yǎng)基中，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)分化率，將篩選出的再生苗轉(zhuǎn)入含有抗生素的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，形成再生植株。

1.5 篩選轉(zhuǎn)基因純合植株

待芽長至1 cm左右時(shí)切下，移入MS生根培養(yǎng)基（含羧芐青霉素400 mg·L-1，卡那霉素50 mg·L-1）中，促其生根，根系發(fā)育好后（5～6片葉），提取葉片組織DNA，進(jìn)行基因CBF1的PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄CBF1基因的擴(kuò)增

通過PCR擴(kuò)增得到山葡萄CBF1基因特異片段，經(jīng)測序結(jié)果為752 bp，與預(yù)期相符，如圖1。山葡萄CBF1基因的開放閱讀框包含752個(gè)核苷酸對。

2.2 山葡萄植物表達(dá)載體pBI121-ViCBF1的構(gòu)建

2.2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 在CBF1基因兩端引入XbaI 和SacⅠ酶切位點(diǎn)，分別用XbaI 和SacⅠ分別酶切目的基因和pBI121載體，構(gòu)建pBI121-ViCBF1表達(dá)載體（圖2）。

2.2.2 植物表達(dá)載體的鑒定 經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒，用XbaI 和SacⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果中出現(xiàn)一條752 bp左右的目的條帶（圖3）。

2.2.3 根癌農(nóng)桿菌菌落PCR檢測 挑選農(nóng)桿菌陽性克隆進(jìn)行菌落PCR檢測，出現(xiàn)預(yù)期條帶（圖4），XbaI 和SacⅠ雙酶切鑒定也顯示同樣大小的目的條帶，表明CBF1插入到了載體中，表明已成功構(gòu)建植物表達(dá)載體，可用于‘巨峰葡萄的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 ‘巨峰葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2.3.1 農(nóng)桿菌的濃度及預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)時(shí)間對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響 農(nóng)桿菌的濃度適宜才能實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化[4-6]。本試驗(yàn)中侵染‘巨峰葡萄的農(nóng)桿菌濃度是OD600=0.6～0.8，侵染時(shí)間控制在6 min最適宜。

外植體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致傷口愈合，不利于外源基因的轉(zhuǎn)化，本試驗(yàn)中適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d（圖5）。外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間太短不利于基因的轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)時(shí)間過長，農(nóng)桿菌過渡繁殖造成外植體的褐化死亡。試驗(yàn)中，‘巨峰葡萄與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)控制在4～5 d（圖6）。

2.3.2 抗生素敏感性試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用羧芐青霉素的抑菌效果進(jìn)行篩選[7]。本試驗(yàn)確定羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1為最適宜濃度，此濃度培養(yǎng)基中農(nóng)桿菌的生長受到有效抑制。

不同植物基因型不同，對卡那霉素的敏感性也不同[8-9]。本試驗(yàn)中，卡那霉素對對‘巨峰葡萄的生長有明顯的抑制作用。當(dāng)卡那霉素濃度為50 mg·L-1時(shí)，‘巨峰葡萄無法正常生長（圖7），此濃度是較為適宜的篩選濃度。因此，以卡那霉素濃度50 mg·L-1，羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1篩選‘巨峰葡萄擬轉(zhuǎn)基因植株（圖8）。

2.3.3 轉(zhuǎn)基因‘巨峰葡萄PCR檢測 僅憑卡那抗性篩選得到的陽性植株，并不能充分說明就是轉(zhuǎn)基因植株。因?yàn)椴煌瑐€(gè)體間的卡那抗性也有差異，另外該基因是否在后代中穩(wěn)定表達(dá)，還需用分子生物學(xué)手段來檢測[10]，最方便快捷的方法是PCR擴(kuò)增。待轉(zhuǎn)基因‘巨峰葡萄長到5～6片葉片時(shí)，為了篩選帶有CBF1基因的轉(zhuǎn)基因‘巨峰葡萄植株，對篩選到的6株擬轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因‘巨峰葡萄6個(gè)單株均擴(kuò)增出了特異性的目的條帶（圖9）。

3 結(jié)論與討論

本研究初步建立了山葡萄CBF1基因的植物表達(dá)載體pBI121-ViCBF1，為了提高pBI121-ViCBF1對‘巨峰葡萄的轉(zhuǎn)化效率，在試驗(yàn)中確立了外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d、農(nóng)桿菌的侵染濃度OD600=0.6～0.8、外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間4～5 d。并對羧芐青霉素濃度及篩選陽性植株的卡那霉素濃度進(jìn)行了優(yōu)化（羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1，卡那霉素濃度50 mg·L-1），以此濃度作為‘巨峰葡萄抗性植株的篩選，88個(gè)外植體篩選到6株擬轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為6.81%，PCR檢測結(jié)果均為陽性，初步說明轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因已經(jīng)整合到‘巨峰葡萄的基因組DNA中。

此外，本研究構(gòu)建了pBI121-ViCBF1單子葉植物表達(dá)載體，利用CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表達(dá)，在提高基因植株耐逆性的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生生長遲緩、植株矮化、產(chǎn)量下降等不良影響，但這種負(fù)效應(yīng)可以用植物內(nèi)源特異性啟動(dòng)子rd29A基因取代CaMV35S來在很大程度上減輕這種負(fù)效應(yīng)，從而提高抗寒基因工程的實(shí)效性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Thomashow M F， Gilmour S J， Stockinger E J， et al. Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation[J]. Plant Physiol， 2001， 112： 171-175.

[2] Gilmour S J， Zarka D G. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activator as an early step in cold induced COR gene expression[J]. Plant J， 1998， 16 （4） ： 433-442.

[3] Jaglo K R， Kleff S， Amundsen K L， et al. Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J]. Plant Physiol， 2001， 127： 910-917.

[4] 嚴(yán)維巍，崔治中，王永坤. 兔出血癥病毒衣殼蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2005，21（1）：135-138.

[5] 梁超，王景雪，裴雁曦，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009（2）：71-74.

[6] 邵敏，周鶴峰，葛正.龍農(nóng)桿菌介導(dǎo)的hIL-12基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（3）：46-49.

[7] 安利佳，李鳳霞，張俊敏，等. 豆科植物組織培養(yǎng)的研究 [J].植物學(xué)報(bào)，1993，34（10）：743-752.

[8] 王關(guān)林，方宏筠. 植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：795-798.

[9] 魏愛民，張文珠，杜勝利，等.黃瓜花粉管通道法抗蟲基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（6）：54-57.

[10] 宋書鋒，曹鳳，楊培志，等. 普那菊苣高效再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].分子植物育種，2006（4）：123-128.

此外，本研究構(gòu)建了pBI121-ViCBF1單子葉植物表達(dá)載體，利用CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表達(dá)，在提高基因植株耐逆性的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生生長遲緩、植株矮化、產(chǎn)量下降等不良影響，但這種負(fù)效應(yīng)可以用植物內(nèi)源特異性啟動(dòng)子rd29A基因取代CaMV35S來在很大程度上減輕這種負(fù)效應(yīng)，從而提高抗寒基因工程的實(shí)效性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Thomashow M F， Gilmour S J， Stockinger E J， et al. Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation[J]. Plant Physiol， 2001， 112： 171-175.

[2] Gilmour S J， Zarka D G. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activator as an early step in cold induced COR gene expression[J]. Plant J， 1998， 16 （4） ： 433-442.

[3] Jaglo K R， Kleff S， Amundsen K L， et al. Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J]. Plant Physiol， 2001， 127： 910-917.

[4] 嚴(yán)維巍，崔治中，王永坤. 兔出血癥病毒衣殼蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2005，21（1）：135-138.

[5] 梁超，王景雪，裴雁曦，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009（2）：71-74.

[6] 邵敏，周鶴峰，葛正.龍農(nóng)桿菌介導(dǎo)的hIL-12基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（3）：46-49.

[7] 安利佳，李鳳霞，張俊敏，等. 豆科植物組織培養(yǎng)的研究 [J].植物學(xué)報(bào)，1993，34（10）：743-752.

[8] 王關(guān)林，方宏筠. 植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：795-798.

[9] 魏愛民，張文珠，杜勝利，等.黃瓜花粉管通道法抗蟲基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（6）：54-57.

[10] 宋書鋒，曹鳳，楊培志，等. 普那菊苣高效再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].分子植物育種，2006（4）：123-128.

此外，本研究構(gòu)建了pBI121-ViCBF1單子葉植物表達(dá)載體，利用CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表達(dá)，在提高基因植株耐逆性的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生生長遲緩、植株矮化、產(chǎn)量下降等不良影響，但這種負(fù)效應(yīng)可以用植物內(nèi)源特異性啟動(dòng)子rd29A基因取代CaMV35S來在很大程度上減輕這種負(fù)效應(yīng)，從而提高抗寒基因工程的實(shí)效性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Thomashow M F， Gilmour S J， Stockinger E J， et al. Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation[J]. Plant Physiol， 2001， 112： 171-175.

[2] Gilmour S J， Zarka D G. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activator as an early step in cold induced COR gene expression[J]. Plant J， 1998， 16 （4） ： 433-442.

[3] Jaglo K R， Kleff S， Amundsen K L， et al. Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J]. Plant Physiol， 2001， 127： 910-917.

[4] 嚴(yán)維巍，崔治中，王永坤. 兔出血癥病毒衣殼蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2005，21（1）：135-138.

[5] 梁超，王景雪，裴雁曦，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009（2）：71-74.

[6] 邵敏，周鶴峰，葛正.龍農(nóng)桿菌介導(dǎo)的hIL-12基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（3）：46-49.

[7] 安利佳，李鳳霞，張俊敏，等. 豆科植物組織培養(yǎng)的研究 [J].植物學(xué)報(bào)，1993，34（10）：743-752.

[8] 王關(guān)林，方宏筠. 植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：795-798.

[9] 魏愛民，張文珠，杜勝利，等.黃瓜花粉管通道法抗蟲基因?qū)爰翱敲顾乜剐院Y選[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（6）：54-57.

[10] 宋書鋒，曹鳳，楊培志，等. 普那菊苣高效再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].分子植物育種，2006（4）：123-128.