彭湘君， 李尚春， 李銀保， 葉海艷， 余 磊

(1. 贛南醫(yī)學院 藥學院, 江西 贛州 341000; 2. 株洲市第十三中學, 湖南 株洲 412000)

0 引 言

益母草為唇形科植物益母草的干燥地上部分，是常用中藥，性味苦、辛、微寒，歸心、肝、膀胱經，具有活血祛瘀、調經、收縮子宮、利尿消腫之功效，主要用于治療月經不調、胎漏難產、行經腹痛及產后瘀阻等癥，被歷代醫(yī)家譽為“血家圣藥”，“經產良藥”，為治療婦科疾病之要藥?！侗静菥V目》云：“益母草行經養(yǎng)血，行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血，誠為血家之圣藥也?！被钚猿煞种饕锌偵飰A，包括益母草堿和水蘇堿等，具有活血調經、利尿消腫、抗炎鎮(zhèn)痛等多種生理活性[1-4]。此外，有研究表明，益母草生物堿能改善大鼠急性心肌梗死后的心功能，具有對抗垂體后葉素急性心肌缺血損傷的作用[5]。近年來，研究益母草中生物堿的提取[2,6]、分離[7-8]、含量測定[9]、鑒定[10-11]的文獻越來越多，也有少量研究益母草黃酮類物質的文獻[12]。本文在綜合各文獻的基礎上，研究了益母草總生物堿的提取、分離、鑒定，為進一步把本實驗內容做為藥學專業(yè)學生“天然藥物化學實驗”課程開設提供最佳的實驗方法和實驗條件，達到實驗目的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

(1) 藥材。干燥益母草 (購自贛州市華爾康大藥房，粉碎后備用)。

(2) 試劑。濃鹽酸、濃硫酸(江西洪都生物化學有限公司)分析純；無水乙醇、甲醇(天津市大茂化學試劑廠)分析純；氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠)分析純；氯化鈉固體(南昌鑫光精細化工廠)分析純；濃氨水(長沙市試劑化工廠)分析純；丙酮(中國上海試劑總廠)分析純；α-萘酚固體(上海亭新化工廠)化學純；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)化學純；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(0.5%)，超純水，碘化鉍鉀試液(按人民衛(wèi)生出版社第二版天然藥物化學實驗指導配制)，三氯化鐵固體(天津市大茂化學試劑廠)分析純；強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(上海展云化工有限公司)。

(3) 實驗儀器。分析天平(梅特勒，德國)；超純水器(Human up900，韓國)；RE-2000型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；UV1900紫外分光光度計(上海亞研電子科技有限公司)；D2F-6050型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法和結果

1.2.1提取和分離

(1) 水提醇沉。取干燥益母草粉末50 g，以1%HCl溶液水煎煮2次，溶劑用量分別為12、9倍量，提取時間均為1.5 h，趁熱過濾，合并濾液，冷卻，濃縮至相對密度約為1.10，加適量乙醇使其乙醇體積分數(shù)達80%，室溫靜置24 h，過濾，濃縮至25 mL，加5%HCl調pH2，過濾，得濾液。

(2) 陽離子交換樹脂前處理。取新732陽離子交換樹脂，用常水浸泡，反復用常水沖洗，去除水溶性雜質，至洗出液澄明無色為止。用約樹脂2倍量的10%的NaCl水溶液浸泡24 h，裝柱，然后用5%的HCl洗滌，至洗出液為無色，蒸餾水洗至近中性，再以5%NaOH洗滌，至洗出液為無色，再以5%HCl洗滌，使陽離子交換樹脂轉為H型，并用超純水洗至pH6～7為止。

(3) 洗脫。濾液上離子交換柱，用超純水洗至不顯Molish反應，加5%HCl洗脫[4]，未洗出生物堿，用3 mol/L NaCl溶液洗脫[5]，未洗出生物堿，用5%氨水洗脫，洗脫出生物堿，一段時間后不易洗出，收集5%氨水洗脫液。改用70%乙醇洗脫，易洗出生物堿，之后又不易洗出，收集洗脫液。再用5%氨水洗脫，易洗出生物堿，洗至生物堿的沉淀反應呈陰性(用碘化鉍鉀檢測)，將2份含益母草生物堿的洗脫液濃縮，常壓75℃烘干，稱重，計算從50 g干燥益母草粉末中提取，用5%氨水和70%乙醇洗脫所得益母草生物堿的含量，含量W(%)=稱重重量(g)/50(g)。結果見表1。

表1 5%氨水和70%乙醇洗脫所得益母草生物堿的含量

1.2.2鑒定

(1) 生物堿的沉淀反應。洗脫時接適量洗脫液于點滴板中，用鹽酸酸化，滴加適量碘化鉍鉀試液，迅速發(fā)生反應，有橘紅色沉淀生成，故洗脫液中含生物堿。

(2) 薄層層析。分別取上述2份干燥生物堿適量溶于70%乙醇中，吸取適量點于同一以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為黏合劑的硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶10∶1)為展開劑，在層析缸中放入一個裝有適量氨水的小燒杯，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液——1%三氯化鐵無水乙醇溶液(2∶1)顯色[13]，冷風吹干，結果兩者都顯一個淡紅色斑點，Rf值均為0.77，表明兩者所含成分相同且為同一種物質。

(3) 紫外光譜測量。分別取適量益母草生物堿標準品和上述2份干燥生物堿分別溶解于0.5%鹽酸甲醇、甲醇，為溶劑，在200～1 100 nm下掃描，得紫外圖譜，結果見表2、3。2份益母草生物堿的紫外圖譜基本一致。綜合以上鑒定，推測兩者所含生物堿成分很有可能相同。

表2 以0.5%鹽酸甲醇為溶劑的紫外光譜

表3 以甲醇為溶劑

2 討 論

由實驗結果可知，用鹽酸水溶液煎煮提取益母草中生物堿，經濟易行且能夠充分提取出有效成分，非常利于天然藥物化學學生實驗的開展。

不同的炮制方法對益母草有效成分的的提取量不同[14]。文獻[15]用陽離子交換樹脂分離純化益母草生物堿的洗脫劑有鹽酸水溶液、氯化鈉水溶液、氨水及含有機溶劑的氨水等，且證明用鹽酸水溶液及氯化鈉水溶液洗脫效果更佳，但本實驗均未洗脫出益母草生物堿，可能是由H+的洗脫能力較弱且洗脫時的流速不夠快導致。而用氨水及70%乙醇水溶液洗脫出生物堿，洗脫速度較快，由計算所得含量可知分離效果較好。傳統(tǒng)的陽離子交換樹純化生物堿工藝大多采用氨水堿化樹脂后氯仿提取法，引入毒性樹脂雜質會減少樹脂使用壽命，洗脫率低，氯仿毒性大且被限制購買，成本高，一定程度上掩蓋了陽離子交換樹脂的真正優(yōu)勢，而用氨水及乙醇的洗脫率較高，毒性小，安全環(huán)保，成本較低，更利于學生實驗的開展。兩者不同比例的混合溶液洗脫益母草生物堿的洗脫率值得進一步研究，以確定兩者最佳比例的洗脫劑，甚至推廣至其他生物堿的分離純化和工業(yè)生產。

本實驗的目的是為學生“天然藥物化學實驗”課程開設提供最佳的實驗方法和實驗條件。購買標準品的成本很高，故薄層層析時未使用標準品作為對照。所得2份益母草生物堿在3種溶劑中的紫外圖譜基本一致，推測兩者所含成分相同。

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