錢 潔， 邢雪松， 梁 軍

(1. 同濟大學 生命科學與技術學院，上海 200092； 2. 高淳區(qū)醫(yī)保中心， 江蘇 南京 211300； 3. 高淳區(qū)雙塔醫(yī)院，江蘇 南京 211300)

0 引 言

骨性關節(jié)炎是一種多發(fā)于中老年的慢性進行性骨關節(jié)病，主要累及關節(jié)軟骨、軟骨下骨質、滑膜、關節(jié)囊及關節(jié)的其他結構，是老年人關節(jié)疼痛和致殘的首要原因，給社會帶來嚴重負擔和大量資源的消耗。由于骨關節(jié)炎的病因和發(fā)病機制還不明確，因此臨床上尚缺乏根本的治療手段，治療效果也往往難以令人滿意，對骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨修復的研究受到很大限制，因此，建立骨性關節(jié)炎的動物模型是研究骨關節(jié)炎發(fā)病機制、預防及治療研究的必要手段，將能更好地理解骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制，為其預防及治療提供理論依據(jù)[1-2]。

本文觀察切斷前交叉韌帶模型及膝關節(jié)制動這兩種實驗方案誘導發(fā)生骨性關節(jié)炎不同分期的病理特點，并對比探討兩種模型產(chǎn)生骨性關節(jié)炎的病理機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley雄性大鼠30只，8周齡，體重200～220 g(SPF級無特定病原體)，同濟大學動物實驗中心提供。隨機分為A組(前交叉韌帶切斷組，15只)和B組(膝關節(jié)制動組，15只)，每組又按時間分為3、6及8周3組(每組5只)。每組左側膝關節(jié)為實驗組，右側對照。實驗大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由活動，自然光照，自由飲食。飼養(yǎng)溫度20～23 ℃，相對濕度為50%～55%。

1.2 動物模型的建立

A組：前交叉韌帶橫斷模型(ALCT 模型)。大鼠用30 g/L戊巴比妥鈉按30 mg/kg量行腹腔麻醉，常規(guī)備皮消毒膝關節(jié)，取左髕旁內側切口顯露膝關節(jié)，切開關節(jié)囊，打開關節(jié)腔，將髕骨向外側脫位，盡量屈曲膝關節(jié)顯露前交叉韌帶，在直視下用小尖刀切斷前交叉韌帶，行抽屜試驗確定前交叉韌帶斷裂，術中不損傷軟骨面，徹底止血，將髕骨復位，逐層關閉切口。對照組作為假手術組，經(jīng)同樣方式進入膝關節(jié)，切開關節(jié)囊，打開關節(jié)腔，將髕骨脫位，屈曲膝關節(jié)顯露前交叉韌帶，不切斷交叉韌帶，然后復位髕骨，閉合關節(jié)腔。術后大鼠不做任何固定措施，每日肌注青霉素40萬U一次，連續(xù)3 d。

B組：膝關節(jié)制動模型。將醫(yī)用棉脂墊于大鼠左側踝至髖關節(jié)之間，以石膏繃帶均勻固定5～6層，將左膝關節(jié)固定于伸直180°位，固定。對照組不做特殊處理。務必注意：①大鼠啃咬石膏，須及時修補；②管型石膏固定松緊應適宜，過緊影響肢體血運，過松則容易脫落，須嚴密觀察固定側肢體末端血運及石膏有無松脫，如發(fā)現(xiàn)足部腫脹明顯或石膏脫落時，及時調整石膏或重新固定。

1.3 標本取材及處理

1.3.1大體觀察

實驗組動物(A組和B組)分別于造模后第3、6及8周采用頸椎脫臼法處死，打開膝關節(jié)，觀察膝關節(jié)有無關節(jié)積液、滑膜腫脹。

1.3.2光鏡標本的取材與處理

實驗組動物(A組和B組)分別于造模后第3、6及8周采用頸椎脫臼法處死，取膝關節(jié)股骨內髁負重部，常規(guī)脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片待后HE及甲苯胺藍染色、光鏡觀察及免疫組化檢測等。

1.4 檢測項目及方法

1.4.1蘇木素-伊紅(HE)染色

光鏡下觀察關節(jié)軟骨關節(jié)面、軟骨細胞、軟骨基質、潮線等情況，由2位獨立的觀察者按Mankin’s 評分原則為切片評分，取兩者平均值作為Mankin’s得分。分級標準：0～1分為正常軟骨；2～6分為早期骨關節(jié)炎；7～10分為中期骨關節(jié)炎；11～14分為晚期骨關節(jié)炎。

1.4.2甲苯胺藍染色

采用Image-Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每個標本取5個視野，10×40高倍鏡下測定單位面積陽性染色平均吸光度值，用以半定量表示細胞基質中蛋白多糖的含量。

1.4.3II型膠原免疫組化染色

購Ⅱ型膠原多克隆抗體、免疫組化染色SP試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，PBS代替一抗為陰性對照。免疫組化實驗步驟按照說明書操作。采用Image-Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每個標本取5個視野，10×40高倍鏡下測定單位面積陽性染色平均吸光度值，半定量表示細胞基質中II型膠原纖維的含量。

1.4.4TUNEL軟骨細胞凋亡染色

購原位細胞凋亡檢測試劑盒(Tunel，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法。武漢博士德生物工程有限公司)，步驟參照試劑盒說明。采用Image-Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每個標本取5個視野，10×40高倍鏡下測定單位面積染色平均吸光度值，用以半定量表示軟骨細胞凋亡的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計方法

用SPSS13.0軟件對計量資料進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組之間的比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 實驗動物的一般觀察

術后第1 d，前交叉韌帶切斷組：精神狀態(tài)及進食飲水較差，活動明顯減少，術后第3 d實驗組動物精神狀態(tài)及進食良好，開始自由活動，切口未見明顯感染癥狀。膝關節(jié)制動組：精神狀態(tài)及飲食良好，活動明顯減少，制動后第2 d實驗動物可以帶石膏板緩慢活動。3～5 d后，實驗動物可自由活動。

2.2 關節(jié)標本的大體觀察

實驗中對照組膝關節(jié)滑膜大體正常，關節(jié)軟骨表面呈淡藍白色，光滑明亮表面完整；實驗組大鼠膝關節(jié)隨著飼養(yǎng)時間的延長，關節(jié)及滑膜腫脹逐漸加重，膝關節(jié)制動組8周時可見軟骨面失去正常光澤。

2.3 關節(jié)軟骨的Mankin評分

各實驗組關節(jié)軟骨Mankin評分結果見表1。

表1 各實驗組關節(jié)軟骨Mankin評分結果比較(x±s)

兩組實驗關節(jié)軟骨損傷Mankin評分均隨實驗時間延長而加重(P<0.05)，同實驗時間關節(jié)制動組Mankin評分高于前交叉韌帶切斷組(P<0.05)。以Mankin分級標準，前交叉韌帶切斷組造模6周為早期OA，8周為中期OA；關節(jié)制動組造模3周為早期OA，6周為中期OA，8周為晚期OA。

2.4 蛋白多糖含量

各組甲苯胺蘭染色吸光度比較見表2。

表2 各實驗組關節(jié)軟骨甲苯胺蘭染色吸光度比較(x±s)

與對照組相比，前交叉韌帶切斷3周組PG的含量明顯增加，而6周、8周組PG的含量明顯減少，P<0.05，8周組PG的含量比6周組也減少明顯，P<0.05。關節(jié)制動各實驗組與對照組相比以及各實驗組隨時間延長軟骨PG的含量都有明顯減少P<0.05，表明關節(jié)制動3周以上可以明顯減少軟骨PG的含量，并且8周內隨持續(xù)時間加長而減少越明顯。

2.5 II膠原纖維含量

各組關節(jié)軟骨II膠原纖維免疫組化染色吸光度比較見表3。

與對照組相比，前交叉韌帶切斷3周組的含量明顯增加而6周、8周組含量明顯減少，P<0.05，8周組含量比6周組也明顯減少P<0.05。為0.39±0.04，3周組0.35±0.05，6周組0.32±0.07，8周組0.24±0.03，關節(jié)制動各實驗組與對照組相比以及各實驗組隨時間延長軟骨II型膠原纖維的含量都明顯減少P<0.05，表明關節(jié)制動3周以上可以明顯減少軟骨基質II型膠原纖維的含量，并且8周內隨持續(xù)時間加長而減少越明顯。

表3 各實驗組關節(jié)軟骨II型膠原免疫 組化染色吸光度比較(x±s)

2.6 軟骨細胞凋亡

各組關節(jié)軟骨TUNEL法軟骨細胞凋亡染色吸光度比較見表4。

表4 各實驗組關節(jié)軟骨TUNEL染色吸光度比較(x±s)

前交叉韌帶切斷實驗組組與對照組相比以及各實驗組間軟骨細胞凋亡都有明顯差異P<0.05，隨持續(xù)時間延長而增加越明顯。關節(jié)制動組與對照組相比以及各實驗組間軟骨細胞凋亡都有明顯增多，P<0.05，表明關節(jié)制動3周以上可以明顯增加軟骨細胞凋亡，并且8周內隨持續(xù)時間加長而越明顯。與韌帶組相比，關節(jié)制動組3周即出現(xiàn)明顯軟骨細胞凋亡，相同持續(xù)時間內，制動組軟骨細胞凋亡明顯增多，P<0.05。

3 討 論

3.1 前交叉韌帶切斷模型的病理分期及特點

前交叉韌帶切斷后造成關節(jié)不穩(wěn)，改變其力學環(huán)境可能導致膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的發(fā)生。有實驗將犬膝關節(jié)前交叉韌帶切斷，觀察到實驗肢體的發(fā)展過程和自然發(fā)生(前交叉韌帶破裂所致) 關節(jié)不穩(wěn)定相一致，并且其最后的病理表現(xiàn)與骨關節(jié)炎相似[3]。王君等[4]在切除兔前交叉韌帶的基礎上固定手術對側肢體使手術側肢體過度負重形成兔膝負重模型，該模型造模時間較單純切斷前交叉韌帶造模時間短。Stoop 等[5]切斷Wistar大鼠的膝關節(jié)前交叉韌帶，于第2、7、14、28、70 d 處死動物，取膝關節(jié)軟骨常規(guī)組織學及免疫組化檢測變性的Ⅱ型膠原，在前交叉韌帶切斷后軟骨損害最早改變發(fā)生于表層帶的軟骨細胞和軟骨基質；術后14 d 出現(xiàn)表層帶軟骨細胞腫脹，表層帶纖維化。術后4周、10周，上述改變更明顯。作者認為軟骨表層早期機械性超負載誘發(fā)軟骨退變，關節(jié)軟骨的退變與Ⅱ型膠原降解產(chǎn)物的局部表達有關，膠原酶在關節(jié)軟骨退變中發(fā)揮重要的作用。

本實驗動態(tài)觀察膝關節(jié)不穩(wěn)定3、6、8周時關節(jié)軟骨細胞、膠原纖維及蛋白多糖的形態(tài)學變化。甲苯胺蘭染色是特異性結合基質中蛋白多糖，其深淺反映蛋白多糖的多少。通過吸光度來反映蛋白多糖、膠原纖維含量，從結果可知制模后軟骨細胞中膠原纖維、蛋白多糖先升高后逐步減少，表現(xiàn)為3周組中TUNEL無明顯變化，II型膠原、甲苯胺蘭染色比正常對照組加深，尤其在軟骨細胞周圍和胞漿內染色加深更明顯，提示軟骨細胞代償性代謝旺盛，分泌蛋白多糖和膠原，可能是軟骨細胞對骨性關節(jié)炎病變的一種修復反應。6周和8周組，隨著病程發(fā)展，到骨性關節(jié)炎中晚期(6周后)II型膠原降解的量大于合成的量，軟骨基質中膠原總量減少，軟骨形態(tài)結構和功能明顯受損，膠原合成也降低，甲苯染色淺淡，部分區(qū)域軟骨全層染色消失，軟骨細胞凋亡數(shù)目增多，變性壞死逐漸加重，表明隨骨關節(jié)炎病變的發(fā)展，軟骨基質合成降低，基質破壞也由表層向深層發(fā)展。以Mankin評分來判定，實驗6周為早期OA，實驗8周為中期OA。

關節(jié)不穩(wěn)定時，由于關節(jié)應力發(fā)生變化(局部增大或減小)會造成關節(jié)的退行性改變，從而導致骨關節(jié)炎的發(fā)生。關節(jié)不穩(wěn)定造成關節(jié)內外力學改變，長期以往使關節(jié)軟骨承受間歇性壓力的糖蛋白逐漸減少，軟骨脫水，膠原纖維顯露，致關節(jié)軟骨退變進行性加重[6-7]。

3.2 關節(jié)固定模型的病理分期及特點

肢體制動作為一種常用的治療或輔助治療手段廣泛應用于各種骨與軟組織疾病和創(chuàng)傷中，然而制動也會對所涉及的骨關節(jié)結構造成新的損傷。關節(jié)制動也是誘發(fā)模型最常用的方式[4]，膝關節(jié)制動模型是在不損傷關節(jié)穩(wěn)定性的情況下，通過關節(jié)制動來誘導大鼠膝關節(jié)軟骨發(fā)生退變。將動物的關節(jié)長期固定于某一位置，限制了關節(jié)的運動，肌肉、關節(jié)囊收縮，對關節(jié)面產(chǎn)生了過度壓力，而且因減少了橫跨膝關節(jié)的肌肉的收縮而導致關節(jié)軟骨的萎縮性變化，這樣便可導致OA 的發(fā)生[8]；制動后4周即出現(xiàn)X線改變，鏡下可見軟骨有糜爛灶，纖維網(wǎng)增粗斷裂消失[9]。有研究發(fā)現(xiàn)7～14 d關節(jié)軟骨出現(xiàn)早期退變，28 d中度，42 d嚴重[10]。動物實驗表明，無論是短期的反復制動或是持續(xù)性制動，若制動時間超過30 d，則可導致關節(jié)軟骨的進行性破壞、進行性OA的發(fā)生[3,11]。關節(jié)制動60 d后，關節(jié)軟骨的變化無法逆轉[9,12]。

本實驗通過對大鼠膝關節(jié)制動時間的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，制動后3周即有軟骨細胞凋亡的發(fā)生，且凋亡主要發(fā)生在表層軟骨細胞，甲苯胺蘭混染，免疫組化低，蛋白多糖、II型膠原含量減少，6周后凋亡呈進展趨勢，出現(xiàn)中層和表層軟骨細胞凋亡，甲苯染色淺淡，部分區(qū)域軟骨全層染色消失，提示基質合成降低，8周軟骨細胞凋亡進一步增多，軟骨細胞變性壞死逐漸加重，甲苯染色全層消失，II型膠原明顯降低。以Mankin評分來判定，膝關節(jié)制動模型組實驗3周為早期，實驗6周為中期OA，實驗8周為晚期OA。

正常關節(jié)軟骨的營養(yǎng)絕大多數(shù)來自于關節(jié)滑液。Pedowitz等[13-14]認為，關節(jié)活動對軟骨營養(yǎng)傳遞極其重要，關節(jié)活動造成關節(jié)軟骨受壓與減壓交替，在滑液流動中，帶入營養(yǎng)物質，帶走代謝產(chǎn)物，形成所謂“軟骨泵”的軟骨營養(yǎng)機制。正常應力環(huán)境對維持關節(jié)軟骨的營養(yǎng)和完整性有非常重要的作用。關節(jié)活動刺激軟骨細胞合成活躍，反之則合成減少，軟骨丟失。關節(jié)固定可造成軟骨壓力泵作用消失、滑膜向軟骨浸潤并與軟骨粘連、肌肉關節(jié)囊攣縮使關節(jié)面壓力升高、軟骨細胞營養(yǎng)障礙，誘發(fā)關節(jié)軟骨萎縮使軟骨變薄水腫，蛋白聚糖含量下降、結構改變，同時膠原合成及含量的減少，最終導致OA。研究顯示，高流體靜壓可以降低葡萄糖轉運蛋白的活性，靜壓負荷可以改變細胞內pH值和離子強度，使蛋白多糖的硫酸化過程受阻，從而對軟骨細胞合成基質的能力造成影響。制動和其他因素使關節(jié)免于負重的方法也導致關節(jié)軟骨未鈣化的部分變薄、變軟以及軟骨下血管出芽的增多和蛋白多糖成分的減少[15]。

3.3 兩種模型的對比

骨關節(jié)炎是機械性和生物性因素相互作用，使關節(jié)軟骨細胞、細胞外基質和軟骨下骨合成與降解失去平衡的結果。膠原和蛋白多糖是關節(jié)軟骨細胞外基質主要組成成分，是軟骨表面張力的決定因素[16]。正常軟骨中軟骨細胞合成的大量膠原纖維(主要是II型膠原)、蛋白多糖等物質分泌到細胞外基質中[17]，構成細胞外纖維網(wǎng)架，支持和保護軟骨細胞，兩者相輔相成相互作用[18]。目前研究認為，關節(jié)軟骨細胞凋亡是骨關節(jié)炎的發(fā)病的主要原因。TUNEL法分析結果顯示骨關節(jié)炎組軟骨細胞凋亡明顯高于正常組，細胞凋亡在骨關節(jié)炎病變區(qū)高于非病變區(qū)。膠原是重要的細胞外基質成分，II型膠原質和量的改變是導致骨關節(jié)軟骨喪失其正常生物力學特性的直接原因，其變化與骨關節(jié)炎有著密切的關系，II型膠原的改變是關節(jié)軟骨喪失其正常生物力學特性的直接原因[10]。

由于不同方法建立的骨性關節(jié)炎模型的病變特點及病理分期不盡相同，根據(jù)不同的方法所建立的OA模型，對后期實驗的影響及后繼治療方法的選擇不盡一致。切斷前交叉韌帶法和膝關節(jié)制動法均可以成功制作膝關節(jié)退變模型，能夠比較全面反映骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨退變的病理過程，但兩種方法誘發(fā)的骨性關節(jié)炎模型也存在一定的差異。

本實驗發(fā)現(xiàn)前叉切斷后首先的病理改變發(fā)生在軟骨表面，表現(xiàn)為軟骨失去光澤、軟化和纖維化等，這些退變與局部膠原降解產(chǎn)物表達有關。蛋白多糖膠原先升后降提示關節(jié)不穩(wěn)定早期，關節(jié)軟骨是損傷和修復并存，如治療不及時，更多的軟骨細胞將出現(xiàn)變性壞死，膠原纖維和蛋白多糖合成受阻，最終軟骨剝脫；固定組蛋白多糖膠原逐周減低，病理進程也發(fā)現(xiàn)與韌帶組同樣變化但較前叉組明顯快且嚴重，3周時細胞凋亡已很明顯，說明軟骨退變更加明顯，Mankin評分也反映相似的軟骨退變情況。前交叉韌帶切斷模型造模時間較長，實驗6周為早期OA，實驗8周為中期OA，基質分解流失是其首動因素；膝關節(jié)制動模型組實驗3周即為早期OA，實驗6周為中期OA，實驗8周為晚期OA，軟骨細胞損傷和基質分解共同發(fā)生作用是其病理特點。

4 結 語

本研究通過切斷前交叉韌帶法和膝關節(jié)伸直位制動法兩種實驗方案建立大鼠膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型，交叉韌帶的損傷可以明顯導致膝關節(jié)的不穩(wěn)定，不給予處理可以誘發(fā)早期的、與年齡無關的關節(jié)軟骨退變；較長時間(3周)的關節(jié)制動可以引起關節(jié)軟骨的萎縮及關節(jié)的僵硬，最終引起關節(jié)軟骨的退變。后期的研究中我們用主動運動來分別干預這兩種骨性關節(jié)炎模型，觀察主動運動對兩種模型的影響。

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