蔡克鋒，李維維，徐訓(xùn)發(fā)，林偉強(qiáng)，許朝祥，陳國(guó)楨

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension)是由多種心、肺或肺血管疾病引起的臨床常見(jiàn)病癥，其嚴(yán)重危害人類的身體健康，受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。肺動(dòng)脈高壓時(shí)因肺循環(huán)阻力增加，右心負(fù)荷增大，最初右心室出現(xiàn)適應(yīng)性改變，導(dǎo)致右心室肥厚，有利于維持心排血量，但隨著肺動(dòng)脈壓的進(jìn)行性升高，當(dāng)肺動(dòng)脈壓升高的速度超過(guò)右心室代償能力時(shí)，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至猝死。因此，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚是當(dāng)前治療肺動(dòng)脈高壓研究的重點(diǎn)之一。以往的研究發(fā)現(xiàn)，肥厚心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于持續(xù)性高水平[1]。Ca2+內(nèi)流能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，參與細(xì)胞的肥大和凋亡，規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位(canonical transient receptor potential，TRPC)亞家族可能參與了這種作用。本研究旨在探討野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的右心室肥厚大鼠模型的心肌細(xì)胞上TRPC6介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是否參與了心肌肥厚的發(fā)病，并探討TRPC6在右心室心肌肥厚中的表達(dá)及其病理生理學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 于2013年2月在上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買健康SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，周齡(7±1)周。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組(CON組)和MCT給藥模型組(MCT組)，各25只。

1.2 方法 CON組大鼠置于常壓和正常氧濃度(21%)飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng)3周，MCT組大鼠以2%MCT 60 mg/kg一次性腹腔注射后常規(guī)飼養(yǎng)3周。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) CON組和MCT組大鼠按照50 U/100 g于腹腔注射肝素，后采取腹腔注射20%氨基甲酸乙酯5 ml/kg麻醉。切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，分離右側(cè)頸外靜脈，將PE50管沿右頸外靜脈送入右心室，記錄大鼠右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)并同步記錄心率(HR)、右心室內(nèi)壓力最大上升/下降速率(right ventricular pressure maximum rate of rise/descent，RV±dp/dtmax)，同法從左側(cè)頸總動(dòng)脈插入導(dǎo)管，記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)。

1.4 右心室肥大指數(shù)(RVMI)計(jì)算 剪開(kāi)大鼠胸腔，剪斷腔靜脈、主動(dòng)脈以及心臟周圍組織，分離右心室(RV)、左心室(LV)及室間隔(S)，并置于濾紙片上吸干多余水分，分別稱質(zhì)量并計(jì)算RVMI，RVMI=RV/(LV+S)。

1.5 心肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取出大鼠心臟，剪除大血管、心包膜、脂肪組織等，濾紙吸干，取右心室心肌靠心尖部組織，置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌病理改變。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)TRPC6 mRNA表達(dá)水平 將約0.1 g右心室組織塊在液氮中充分研磨后，提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度及純度。用β-actin作為內(nèi)參照進(jìn)行RT-PCR，建立10 μl PCR反應(yīng)體系：H2O 4.15 μl，ROX 5 μl，PCR Forward Primer 0.3 μl，PCR Reverse Primer 0.3 μl(見(jiàn)表1)，cDNA 0.25 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s、60 ℃退火1 min、70 ℃延伸 1 min，40個(gè)循環(huán)。

表1 β-actin及TRPC6 mRNA引物序列

1.7 Western blotting方法檢測(cè)TRPC6蛋白表達(dá)水平 右心室心肌組織用液氮研磨后，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg總蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后行轉(zhuǎn)膜印跡，分別用兔抗大鼠TRPC6抗體或大鼠抗大鼠β-actin抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))與膜上的抗原結(jié)合，然后用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗與其反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光試劑Novex ECL(Invitrogen，美國(guó))檢測(cè)，經(jīng)壓片曝光后顯影和定影。采用Phoretix 1D圖像分析軟件分析蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 飼養(yǎng)3周后，CON組大鼠死亡1只，MCT組大鼠死亡7只。CON組大鼠體質(zhì)量(221±15)g，周齡(10±1)周；MCT組體質(zhì)量(198±17)g，周齡(10±1)周。兩組大鼠體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.645，P<0.001)；兩組大鼠周齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.000，P=1.000)。

2.2 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和RVMI比較 CON組和MCT組MAP和HR比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MCT組RVSP、RVMI、RV+dp/dtmax高于CON組，RV-dp/dtmax低于CON組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和RVMI比較

注：RVSP=右心室收縮壓，MAP=平均動(dòng)脈壓，HR=心率，RV+dp/dtmax=右心室壓力最大上升速率，RV-dp/dtmax=右心室壓力最大下降速率，RVMI=右心室肥大指數(shù)

2.3 右心室心肌組織病理學(xué)觀察 HE染色可見(jiàn)CON組大鼠右心室心肌細(xì)胞排列有序，胞核清晰(見(jiàn)圖1A)。MCT組右心室心肌纖維粗大，細(xì)胞內(nèi)肌原纖維數(shù)量增多，心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核深染，形狀不整(見(jiàn)圖1B)。

圖1 兩組右心室心肌組織病理切片(HE染色，×400)

Figure1 Pathological sections of right ventricular tissues of the two groups

2.4 兩組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達(dá)水平比較 CON組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達(dá)水平為(1.00±0.51)，MCT組為(2.49±0.96)，MCT組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達(dá)水平高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.33，P<0.05)。

2.5 兩組右心室心肌組織TRPC6蛋白表達(dá)水平比較 CON組右心室心肌組織TRPC6蛋白表達(dá)水平為(1.00±0.46)，MCT組為(2.90±0.32)。MCT組右心室心肌組織TRPC6蛋白表達(dá)水平高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.99，P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 TRPC6蛋白在大鼠右心室心肌組織的表達(dá)情況

3 討論

MCT屬雙稠吡咯啶生物堿，其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后可在肝臟內(nèi)經(jīng)P450單氧化酶轉(zhuǎn)化為有活性的MCT吡咯，可選擇性地?fù)p傷肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮源性NO合成及分泌減少，增加釋放收縮血管物質(zhì)，如內(nèi)皮素、血小板源性生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，引起肺動(dòng)脈血管腔狹窄甚至堵塞及肺動(dòng)脈血管收縮，同時(shí)由于內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落容易啟動(dòng)內(nèi)源性和外源性凝血途徑，形成血栓，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[2-3]。肺動(dòng)脈高壓早期，右心室尚能代償，舒張末期壓仍正常，隨著病情的進(jìn)展，特別是急性加重期，肺動(dòng)脈壓持續(xù)升高且嚴(yán)重，超過(guò)右心室負(fù)荷，右心失代償，右心排血量下降，右心室收縮末期殘留血量增加，舒張末壓增高，促使右心室擴(kuò)大、右心衰竭甚至死亡。Tofovic等[4]研究結(jié)果顯示，MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型可以模擬人類原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓癥的發(fā)病過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈高壓引起RVSP顯著升高，引起心肌組織代償性肥大，導(dǎo)致RVMI顯著升高，右心室心肌組織切片HE染色可見(jiàn)心肌纖維粗大，細(xì)胞內(nèi)肌原纖維數(shù)量增多，心肌纖維排列紊亂，切面可見(jiàn)部分心肌纖維排列擁擠，細(xì)胞核深染，形狀不整。RV+dp/dtmax顯著升高，RV-dp/dtmax顯著降低，提示右心室收縮、舒張功能代償性增強(qiáng)，證明MCT誘導(dǎo)3周大鼠右心室心肌肥厚模型成功建立。且此模型方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好。

本研究結(jié)果證實(shí)在大鼠心肌細(xì)胞能夠檢測(cè)TRPC6表達(dá)，且TRPC6 mRNA及蛋白表達(dá)水平在MCT組中發(fā)生明顯上調(diào)。目前已有研究表明，TRPC6通道在心肌肥厚中發(fā)揮重要作用[5]。TRPC6是含有931個(gè)氨基酸的蛋白，有6次跨膜的結(jié)構(gòu)，其N端和C端均在胞內(nèi)，第5個(gè)和第6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成了非選擇性陽(yáng)離子通道[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6更多地參與對(duì)肺血管緊張度的調(diào)節(jié)[7]。Kinoshita等[8]研究發(fā)現(xiàn)，GC-A基因缺失后的小鼠，由于解除了GC-A對(duì)TRPC6的抑制作用引起心臟鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/激活T細(xì)胞核因子(CaN/NFAT)信號(hào)通路的激活，從而導(dǎo)致心肌肥厚。本研究以不同的造模方式——MCT誘導(dǎo)，進(jìn)一步證實(shí)TPRC6通道的基因表達(dá)上調(diào)可能與心肌肥厚有關(guān)。

本研究以MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室心肌肥厚模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，MCT可以導(dǎo)致RVSP增高，使右心室心肌收縮和舒張功能增強(qiáng)；MCT組RVMI、TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于CON組，說(shuō)明MCT可誘導(dǎo)SD大鼠產(chǎn)生右心室心肌肥厚，上調(diào)了編碼右心室心肌細(xì)胞TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)，提示TRPC6可能參與右心室心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，其可能成為治療肺動(dòng)脈高壓所致右心室肥厚的新靶點(diǎn)。但本研究采用的MCT誘導(dǎo)右心室肥厚模型是間接通過(guò)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓進(jìn)而導(dǎo)致右心室肥厚而實(shí)現(xiàn)的，而MCT對(duì)右心室有無(wú)直接影響目前尚不清楚，TRPC亞家族其他成員在右心室肥厚中的表達(dá)情況如何，尚待進(jìn)一步研究。

1 Vieillard-Baron A，F(xiàn)risdal E，Eddahibi S，et al.Inhibition of matrix metalloproteinases by lung TIMP-1 gene transfer or doxycycline aggravates pulmonary hypertension in rats[J].Circ Res，2000，87(5)：418-425.

2 Scotland RS，Chauhan S，Davis C，et al.Vanilloid receptor TRPV1，sensory C-fibers，and vascular autoregulation：a novel mechanism involved in myogenic constriction[J].Circ Res，2004，95(10)：1027-1034.

3 H?gest?tt ED，Zygmunt PM.Cardiovascular pharmacology of anandamide[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2002，66(2/3)：343-351.

4 Tofovic SP，Zhang X，Zhu H，et al.2-Ethoxyestradiol is antimitogenic and attenuates monocrotaline-induced pulmonary hypertension and vascular remodeling[J].Vascul Pharmacol，2008，48(4/6)：174-183.

5 Nakayama H，Wilkin BJ，Bodi I，et al.Calcineurin-dependent cardiomyopathy is activated by TRPC in the adult mouse heart[J].FASEB J，2006，20(10)：1660-1670.

6 余冬梅.經(jīng)典瞬時(shí)感受器陽(yáng)離子通道研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2011，40(25)：2591-2593.

7 黃超賢，張萃.TRPC6與疾病研究進(jìn)展[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2011，17(6)：765-767.

8 Kinoshita H，Kuwahara K，Nishida M，et al.Inhibition of TRPC6 Channel activity contributes to the antihypertrophic effects of natriuretic peptides-guanylyl cyclase-A signaling in the heart[J].Circ Res，2010，106(12)：1849-1860.