張俊霞，徐金升，王雙宇，白亞玲，張勝雷，崔立文，張慧然

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者的主要并發(fā)癥之一[1-2]，血管、心臟瓣膜和心肌鈣化是導(dǎo)致CKD患者發(fā)生CVD的重要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示，40%的CKD患者發(fā)生血管鈣化[3-4]。血管鈣化是由多種細(xì)胞、分子參與的類似于骨形成和骨質(zhì)疏松發(fā)生的主動(dòng)調(diào)節(jié)過程，是預(yù)測(cè)CVD病死率的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]，但其發(fā)生機(jī)制迄今尚未完全闡明。血管平滑肌細(xì)胞是血管中膜最主要的細(xì)胞成分，其發(fā)生類成骨/成軟骨樣的表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其特點(diǎn)是出現(xiàn)骨源性基因的表達(dá)上調(diào)，尤其是核心結(jié)合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)被視為表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物。隨著對(duì)血管鈣化研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)鎂離子對(duì)血管鈣化有保護(hù)性作用[6-8]，但目前尚不清楚鎂離子對(duì)CKD患者的血管鈣化是否有保護(hù)作用。為此，本研究建立了慢性腎衰竭大鼠血管鈣化模型，通過外源性補(bǔ)充鎂離子，觀察其對(duì)血管鈣化及彈性功能的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，32只，雄性，5周齡，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：1210076。

1.2 主要儀器和試劑 甲基纖維素、硫酸腺嘌呤(美國(guó)sigma公司)；動(dòng)物飼料(北京華阜康生物有限公司)；RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)thermo公司)；鈣水平測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；Unicel Dxc800全自動(dòng)生化分析儀(Beckman公司)；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成(見表1)。

表1 引物序列

注：Cbfα1=核心結(jié)合因子α1；GADPH為內(nèi)參基因

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模方法 將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為4組，即對(duì)照組(A組)、慢性腎衰竭血管鈣化組(B1組)、低鎂組(B2組)、高鎂組(B3組)。參照文獻(xiàn)[9]制備大鼠血管鈣化模型,將32只健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)高磷飼料2周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。A組給予1.5%甲基纖維素6 ml/kg在1～3周時(shí)每天灌胃，4～15周時(shí)給予高磷飲食(P：1.2%、Ca：1%、 Mg：0.05%)。B1組1～3周時(shí)給予硫酸腺嘌呤懸濁液(硫酸腺嘌呤溶于1.5%甲基纖維素中制成100 mg/ml的懸濁液)6 ml·kg-1·d-1灌胃，4～15周時(shí)給予高磷飲食(P：1.2% 、Ca：1%、 Mg：0.05%)。B2組1～3周時(shí)給予硫酸腺嘌呤懸濁液6 ml·kg-1·d-1灌胃，4～15周時(shí)給予高磷低鎂飲食(P：1.2%、Ca：1%、Mg：0.02%)。B3組1～3周時(shí)給予硫酸腺嘌呤懸濁液6 ml·kg-1·d-1灌胃，4～15周時(shí)給予高磷高鎂飲食(P：1.2%、Ca：1%、Mg：0.15%)。

1.3.2 主動(dòng)脈脈搏波速率(PWV)的測(cè)定及動(dòng)脈血管標(biāo)本的采集 實(shí)驗(yàn)15周末，用2%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉所有大鼠，暴露頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈，全身肝素化后插入腰椎麻醉導(dǎo)管，用多導(dǎo)電生理儀測(cè)量波形，解剖大鼠后測(cè)定兩導(dǎo)管尖端距離，計(jì)算PWV值?？焖偃〈笫笮刂鲃?dòng)脈置于凍存管中，放于液氮罐中保存，留取做反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)；取部分腹主動(dòng)脈進(jìn)行von Kossa染色法[10]測(cè)定主動(dòng)脈鈣化情況。剩余腹主動(dòng)脈烤干至質(zhì)量不再改變，留取測(cè)量鈣水平。慢性腎衰竭血管鈣化造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：腎臟HE染色腎小管內(nèi)可見棕黑色結(jié)晶,異物巨細(xì)胞肉芽腫形成,灶狀腎小管擴(kuò)張,間質(zhì)灶片狀淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化；主動(dòng)脈von Kossa染色后，主動(dòng)脈血管中膜可見棕黑色顆粒沉積；血肌酐、尿素氮、血磷均高于A組。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)血管組織中Cbfα1 mRNA的表達(dá) 采用RNA分離試劑盒Trizol提取并純化組織總RNA。分光光度法測(cè)定提取的總RNA水平。PCR反應(yīng)在ABI5700型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s(共35個(gè)循環(huán))，最后于72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V 30 min)，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelPro Analyzer 3.0)分析Cbfα1與GADPH基因條帶吸光度值。Cbfα1 mRNA的表達(dá)量采用gel-Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.3.4 血管壁鈣水平的測(cè)定 取腹主動(dòng)脈烤干至質(zhì)量不再改變后稱重，置于1 mmol/L的鹽酸中37 ℃消化過夜，用鈣水平測(cè)定試劑盒(鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法)，酶標(biāo)儀測(cè)定。血肌酐、尿素氮、血鈣、血磷、血鎂水平的測(cè)定由Unicel Dxc800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 慢性腎衰竭大鼠血管鈣化模型的構(gòu)建 B1組血肌酐、尿素氮、血磷水平分別為(172.6±10.8) μmol/L、(23.9±2.2) mmol/L 、(3.8±0.1) mmol/L，高于A組的(37.7±4.8) μmol/L、(6.5±0.4) mmol/L 、(2.5±0.1) mmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.284、22.010、26.000，P<0.05)；腎臟病理改變：腎小管內(nèi)可見大量棕黑色結(jié)晶,異物巨細(xì)胞肉芽腫形成,灶狀腎小管擴(kuò)張,部分可見少量蛋白管型,間質(zhì)灶片狀淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化(見圖1)；B1組主動(dòng)脈von Kossa染色后，主動(dòng)脈血管中膜可見大量棕黑色顆粒沉積(見圖2A)。

2.2 4組血鎂水平比較 A組血鎂水平為(0.9±0.1)mmol/L、B1組為(0.9±0.5) mmol/L、B2組為(0.6±0.5) mmol/L、B3組為(1.4±0.6) mmol/L，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.745，P<0.05)。B3組血鎂水平高于B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.897，P<0.05)。

2.3 4組胸主動(dòng)脈鈣化及鈣水平比較 A組主動(dòng)脈鈣水平為(2.9±0.3) μg/mg、B1組為(8.1±0.6) μg/mg、B2組為(12.4±0.7) μg/mg、B3組為(5.3±0.6) μg/mg，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.824，P<0.05)。B2組主動(dòng)脈鈣水平高于B1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=13.192，P<0.05)；B1組主動(dòng)脈鈣水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=21.925，P<0.05)；B3組主動(dòng)脈鈣水平低于B1組和B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=9.333、21.782，P<0.05)。von Kossa染色及主動(dòng)脈鈣水平測(cè)定發(fā)現(xiàn)B1組發(fā)生了明顯的主動(dòng)脈鈣化(見圖2A)，B2組主動(dòng)脈鈣化更加嚴(yán)重(見圖2B)，B3組主動(dòng)脈鈣化明顯減輕(見圖2C)。

注：大鼠腎臟間質(zhì)灶片狀淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化

圖1 慢性腎衰竭血管鈣化大鼠腎臟病理結(jié)果(HE染色，×200)

Figure1 Pathology results of the chronic renal failure rats with vascular calcification

注：A為B1組主動(dòng)脈鈣化情況,大鼠主動(dòng)脈血管中膜大量棕黑色顆粒沉積；B為B2組主動(dòng)脈鈣化情況；C為B3組主動(dòng)脈鈣化情況

圖2 大鼠胸主動(dòng)脈鈣化情況(von Kossa染色，×100)

Figure2 The rat thoracic aortic calcification

2.4 4組胸主動(dòng)脈PWV值比較 A組胸主動(dòng)脈PWV值為(1.3±0.1) m/s、B1組為(2.9±0.3) m/s、B2組為(6.1±0.6) m/s、B3組為(2.1±0.3) m/s，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.454，P<0.05)。B2組主動(dòng)脈PWV值高于B1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=13.492，P<0.05)；B1組PWV值高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=14.311，P<0.05)；B3組PWV值低于B1組和B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.333、16.865，P<0.05)。

2.5 4組胸主動(dòng)脈血管Cbfα1 mRNA表達(dá)情況比較 A組胸主動(dòng)脈Cbfα1 mRNA表達(dá)量為(0.56±0.03)、B1組為(0.67±0.03)、B2組為(1.72±0.24)、B3組為(0.54±0.02)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.212，P<0.05)。B1組和B2組Cbfα1 mRNA表達(dá)量高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.333、13.565，P<0.05)；B3組Cbfα1 mRNA表達(dá)量低于B1組和B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=10.198、13.858，P<0.05)；B2組Cbfα1 mRNA表達(dá)量高于B1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=12.279，P<0.05，見圖3)。

注：Cbfα1 =核心結(jié)合因子α1

圖3 大鼠胸主動(dòng)脈Cbfα1 mRNA表達(dá)情況

Figure3 The rat thoracic aorta Cbfα1 mRNA expression

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化是類似骨發(fā)育的、主動(dòng)的、可調(diào)控的、多種因素綜合作用的生物學(xué)過程[11-12]。CKD患者的血管鈣化除了受傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素影響外，還與尿毒癥相關(guān)因素有關(guān)，如高磷血癥[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞在高磷培養(yǎng)基中出現(xiàn)了鈣化，該鈣化過程可以被鎂離子有效抑制，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-17]。

鎂是體內(nèi)占第4位的陽(yáng)離子,其中60%在骨骼中,是骨鹽的組成成分[18]。鎂具有多種生理功能,包括調(diào)節(jié)各種離子通道的電子流，催化多種酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、再生和膜結(jié)構(gòu)，維持心肌、骨骼肌及胃腸道平滑肌興奮性等[19-20]。本研究在慢性腎衰竭大鼠血管鈣化模型上發(fā)現(xiàn)，B2組主動(dòng)脈血管鈣化更嚴(yán)重，血管內(nèi)膜、外膜也發(fā)生了鈣化,血管組織鈣水平也更高；B3組主動(dòng)脈血管鈣化程度則明顯減輕，提示鎂離子具有抑制血管鈣化的作用。

為了探討鎂離子對(duì)血管鈣化抑制作用的具體機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了胸主動(dòng)脈Cbfα1 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)B1組大鼠主動(dòng)脈Cbfα1 mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，與Montezano等[21]報(bào)道的結(jié)果一致。Cbfα1作為平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物，提示高血磷誘導(dǎo)慢性腎衰竭大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化，平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化尤其是中膜鈣化發(fā)生的關(guān)鍵步驟，這從平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的角度也解釋了為什么高磷可以導(dǎo)致血管鈣化。本研究結(jié)果顯示，B3組的胸主動(dòng)脈Cbfα1 mRNA表達(dá)量低于B1組、鈣化減輕，提示鎂離子有可能是通過抑制平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化來抑制血管鈣化的。但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，B3組主動(dòng)脈PWV值明顯低于B1組，提示B3組血管彈性功能明顯優(yōu)于B1組，更加印證了鎂離子具有抑制血管鈣化的作用。

綜上所述，鎂離子可能是通過抑制高磷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化來抑制血管鈣化、改善血管彈性功能的，有望成為防治血管鈣化的有效藥物之一。但本研究?jī)H在基因水平上進(jìn)行了驗(yàn)證，且為動(dòng)物模型，因此將其結(jié)果外推到人還需在蛋白水平、血管鈣化的分子機(jī)制及改變研究對(duì)象上進(jìn)行深入研究。

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