鄔黎青，詹 媛，王 莉，陳 玲，陳小青，楊 洋，高 歌，郝 華

Nutlin-3a是近幾年發(fā)現(xiàn)的MDM2小分子拮抗劑，能結(jié)合到MDM2上的 p53位點(diǎn)，阻止MDM2與p53結(jié)合，穩(wěn)定內(nèi)源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，引起細(xì)胞凋亡。在p53缺失或p53基因突變的癌細(xì)胞中，Nutlin-3a能阻止MDM2與p73α結(jié)合，增加內(nèi)源性p73α的轉(zhuǎn)錄活性[5-6]，同時(shí)p73α能激活p53應(yīng)答基因，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，引起細(xì)胞凋亡。以前認(rèn)為低量的p53引起細(xì)胞靜止，而高量的p53導(dǎo)致細(xì)胞老化或凋亡[7]。然而2010年有研究顯示，低濃度Nutlin-3a誘導(dǎo)p53低表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞老化；而高濃度Nutlin-3a誘導(dǎo)p53高表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡(凋亡及有絲分裂死亡)的同時(shí)，又把部分癌細(xì)胞阻滯在靜止期，這些靜止期的細(xì)胞撤藥后能恢復(fù)進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行生長(zhǎng)增殖[8-9],這限制了Nutlin-3a的治療作用。腫瘤中p53基因突變很常見(jiàn)，而p73α基因突變卻罕見(jiàn)[10]。對(duì)于p53基因突變的腫瘤，Nutlin-3a不能誘導(dǎo)其內(nèi)源性p53的產(chǎn)生，但可通過(guò)誘導(dǎo)p73α來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的。 Nutlin-3a抑制含野生型p53基因的結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究已有發(fā)表[11]，但Nutlin-3a對(duì)p53基因突變的結(jié)腸癌細(xì)胞的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。 本課題研究Nutlin-3a對(duì)p53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞株Coca-2的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑、細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) Nutlin-3a〔Sigma，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，10 mmol/L小試劑瓶分裝，-20 ℃保存〕； DMEM高糖液體培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；p73α及p21抗體購(gòu)自美國(guó)Abcom公司； MTT試劑盒、β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。人體結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2(上海中科院細(xì)胞庫(kù))，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃潮濕環(huán)境中。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn) 收集并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至合適濃度，每孔加入200 μl接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后吸棄上清，實(shí)驗(yàn)設(shè)8組(對(duì)照組及不同濃度Nutlin-3a組)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別加入0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μmol/L的Nutlin-3a培養(yǎng)液200 μl，分別培養(yǎng)24、48、72 h。避光條件下進(jìn)行如下操作：棄去舊培養(yǎng)基，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2遍，加入新培養(yǎng)基200 μl后，每孔再加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO,使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 mm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度(OD570 nm)。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD570 nm/對(duì)照組OD570 nm)×100%。

1.3 Western blotting法 將Caco-2細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿(調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)/皿)；24 h后用不同濃度Nutlin-3a培養(yǎng)液培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞；72 h后倒掉培養(yǎng)液，Western blotting法檢測(cè)p73α及p21蛋白表達(dá)。最后行光密度分析：通過(guò)Gel．Pro analyzer圖像分析系統(tǒng)讀取目的條帶在X光膠片測(cè)得的光密度值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其蛋白表達(dá)量。

1.4 衰老相關(guān)β-Gal染色 β-Gal聚集在老化細(xì)胞的溶酶體中，在老化細(xì)胞中高表達(dá)，被作為老化細(xì)胞的生物標(biāo)志物。β-Gal染色是以X-Gal為底物，X-Gal經(jīng)糖β-Gal切割后生成藍(lán)綠色的沉積產(chǎn)物，該產(chǎn)物在顯微鏡下容易被觀察到而用來(lái)探測(cè)和鑒別衰老細(xì)胞。將Caco-2細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿；24 h后用不同濃度Nutlin-3a培養(yǎng)液培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞；72 h后按照衰老相關(guān)β-Gal染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行β-Gal染色實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞集落形成分析 將Caco-2細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿(調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)/皿)；24 h后用不同濃度Nutlin-3a培養(yǎng)液培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞；72 h后用PBS清洗細(xì)胞3次，然后用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否增生，細(xì)胞微集落是否形成；繼續(xù)用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，PBS清洗后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞集落(>50個(gè)細(xì)胞/集落)的形成。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組及不同濃度Nutlin-3a組不同時(shí)間吸光度及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 對(duì)照組及不同濃度Nutlin-3a組不同時(shí)間吸光度及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Nutlin-3a濃度與處理時(shí)間存在交互作用(P<0.05)；對(duì)照組及不同濃度Nutlin-3a組吸光度及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

Table1 Comparison of absorbance value and cell inhibition rate between control group and Nutlin-3a groups with different concentrations and among different times

組別吸光度24h 48h 72h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)24h 48h 72h對(duì)照組0 72±0 081 15±0 060 76±0 05---2 5μmol/L組0 51±0 030 71±0 050 59±0 0328 61±1 4938 11±0 9738 46±1 305 0μmol/L組0 42±0 140 69±0 090 45±0 0841 84±0 2240 29±1 3253 01±1 0610 0μmol/L組0 37±0 100 35±0 130 18±0 0151 27±1 3169 19±1 5281 08±1 0220 0μmol/L組0 26±0 040 18±0 110 14±0 0363 73±1 0184 07±1 8485 55±1 3440 0μmol/L組0 17±0 030 13±0 040 08±0 0177 02±0 7188 68±0 5391 68±0 8660 0μmol/L組0 12±0 060 09±0 050 07±0 0282 87±0 3291 99±0 8695 01±0 6280 0μmol/L組0 10±0 020 06±0 010 05±0 0185 65±0 6594 68±0 2097 40±0 51F值F交互=4 65，F(xiàn)組間=21 29，F(xiàn)時(shí)間=68 59F交互=8 92，F(xiàn)組間=19 67，F(xiàn)時(shí)間=20 49P值P交互=0 026，P組間<0 001，P時(shí)間<0 001P交互<0 001，P組間<0 001，P時(shí)間<0 001

注：-為無(wú)此項(xiàng)

2.2 對(duì)照組及不同濃度 Nutlin-3a組p73α及p21蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組及不同濃度 Nutlin-3a組p73α及p21蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10.0 μmol/L組、20.0 μmol/L組、40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p73α蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，10.0 μmol/L組、20.0 μmol/L組、40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p73α蛋白表達(dá)高于2.5 μmol/L組，20.0 μmol/L組、40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p73α蛋白表達(dá)高于5.0 μmol/L組，60.0 μmol/L組和80.0 μmol/L組p73α蛋白表達(dá)高于10.0 μmol/L組，80.0 μmol/L組p73α蛋白表達(dá)高于20.0 μmol/L組和40.0 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；40.0 μmol/L組、60.0 μmol/L組、80.0 μmol/L組p21蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，60.0 μmol/L組和80.0 μmol/L組p21蛋白表達(dá)高于2.5 μmol/L組和5.0 μmol/L組，80.0 μmol/L組p21蛋白表達(dá)高于10.0 μmol/L組和20.0 μmol/L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2、圖1)。

Table2 Comparison of levels of p73α and p21 protein between control group and Nutlin-3a groups with different concentrations

組別p73αp21對(duì)照組1 23±0 111 02±0 082 5μmol/L組2 75±0 26?1 75±0 465 0μmol/L組3 15±0 35?1 86±0 6110 0μmol/L組4 36±0 16?△2 44±0 3720 0μmol/L組4 83±0 34?△▲2 56±0 6840 0μmol/L組5 06±0 46?△▲3 43±0 56?60 0μmol/L組5 56±0 63?△▲☆4 09±0 46?△▲80 0μmol/L組6 56±0 35?△▲☆★●4 65±0 51?△▲☆★F值65 7618 72P值<0 001<0 001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與2.5 μmol/L組比較，△P<0.05；與5.0 μmol/L組比較，▲P<0.05；與10.0μmol/L組比較，☆P<0.05；與20.0 μmol/L組比較，★P<0.05；與40.0 μmol/L組比較，●P<0.05

圖1 對(duì)照組及不同濃度 Nutlin-3a組p73α及p21蛋白表達(dá)

Figure1 The expression of P73α and P21 protein in control group and Nutlin-3a groups with different concentrations

2.3 β-Gal染色結(jié)果 Nutlin-3a濃度為2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L時(shí)可導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞老化，細(xì)胞呈現(xiàn)大而扁平的老化形態(tài)學(xué)改變，老化細(xì)胞β-Gal染色呈藍(lán)綠色；當(dāng)Nutlin-3a濃度為40.0、60.0、80.0 μmol/L時(shí)，大量細(xì)胞壞死，殘存的細(xì)胞體積變小，呈現(xiàn)出細(xì)胞靜止的形態(tài)學(xué)改變，衰老相關(guān)β-Gal染色陰性(見(jiàn)圖2)。

2.4 細(xì)胞集落形成分析結(jié)果 對(duì)照組及不同濃度Nutlin-3a組不同時(shí)間Caco-2細(xì)胞數(shù)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Nutlin-3a濃度與處理時(shí)間存在交互作用(P<0.05)；對(duì)照組及不同濃度Nutlin-3a組Caco-2細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

Table3 Comparison of Caco-2 cell count of control group and Nutlin-3a groups with different concentrations in different time points

組別處理72h撤藥72h撤藥144h對(duì)照組172324±4361189357±3461242184±38152 5μmol/L組144578±2461164553±2876198672±29435 0μmol/L組112645±3618125678±3176126646±196310 0μmol/L組78642± 56887562± 61190432± 53420 0μmol/L組45614± 24951468± 29169623± 34940 0μmol/L組15568± 34955646± 315106158± 38160 0μmol/L組11837± 24852424± 169101238± 21780 0μmol/L組10229± 17948123± 23497623± 496F值F交互=18 10，F(xiàn)組間=4 26，F(xiàn)時(shí)間=5 78P值P交互<0 001，P組間<0 001，P時(shí)間=0 017

圖2 對(duì)照組及不同濃度 Nutlin-3a組β-Gal染色結(jié)果

3 討論

研究表明Nutlin-3a在含野生型p53的各種癌癥治療中有效,而在突變型p53中無(wú)效[12]。Nutlin-3a通過(guò)結(jié)合到MDM2的 p53位點(diǎn)，阻斷MDM2與p53結(jié)合，抑制MDM2對(duì)p53的降解，穩(wěn)定內(nèi)源性野生型p53并激活p53通路[1-4]，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并引起細(xì)胞凋亡。50%以上的腫瘤中p53基因發(fā)生突變，而p73α基因突變卻罕見(jiàn)。MDM2與p73α結(jié)合后，不能降解p73α，但能抑制p73α的轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞內(nèi)p73蛋白含量減少[13]。 p73α結(jié)合在MDM2的N-端疏水基團(tuán)上，這也是Nutlin-3a的結(jié)合部位。Nutlin-3a結(jié)合此部位后，阻斷了p73α與MDM2的結(jié)合，從而解除MDM2對(duì)p73α的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，含突變型p53基因的結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞經(jīng)Nutlin-3a處理后，Nutlin-3a濃度增高，p73α及p21蛋白表達(dá)也有所增加。p73α基因是p53基因的家族成員，具有與p53相似的功能，在抑制腫瘤的發(fā)生中有重要作用。人p73 基因有α、β、γ、δ和 ε等多個(gè)同源異構(gòu)體，是由于p73轉(zhuǎn)錄時(shí)不同地剪接及利用不同的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄造成的，其不同在于N-及C-末端。p73α是全長(zhǎng)p73，由 636個(gè)氨基酸組成，其C-末端的142個(gè)氨基酸是其獨(dú)有的。p73α基因的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于p53基因，具有p53基因相似的功能基團(tuán)及相似的生物活性[14]，能激活p53應(yīng)答基因如p21、Bax、Puma和Noxa等而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，引起細(xì)胞凋亡[15-16]。其中，p21是強(qiáng)有力的周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，能使細(xì)胞停滯在G1期，不進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增生。p73α的增高會(huì)引起凋亡相關(guān)蛋白Bax、Puma及Noxa的增高，故細(xì)胞凋亡增加，殘存的細(xì)胞減少。此外，p21亦能介導(dǎo)細(xì)胞老化，在許多細(xì)胞中，過(guò)度表達(dá)p21均能引起細(xì)胞老化，而敲除p21則能延緩細(xì)胞老化。細(xì)胞老化是指細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)生G1/S期阻滯，不可逆地喪失增殖潛能、具有大而扁平的形態(tài)特征、表達(dá)特征性生物標(biāo)記β-Gal。

本研究結(jié)果顯示，2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a誘導(dǎo)p21蛋白表達(dá)量較低，引起較多細(xì)胞老化，而40.0～80.0 μmol/L的Nutlin-3a所誘導(dǎo)的p21蛋白表達(dá)量較高，使殘存的細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，這似乎與上述p21的作用相反。其實(shí)，除p21外，細(xì)胞的狀態(tài)受多種蛋白的影響。細(xì)胞對(duì)靜止期及老化期的選擇還部分取決于絲/蘇氨酸激酶mTOR(mammalian target of rapamycin)的活性。當(dāng)mTOR活性被p53及p73靶基因TSC2(tuberous sclerosis 2)抑制時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入靜止期；當(dāng)mTOR活性未被抑制或未被完全抑制時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入老化期。高濃度Nutlin-3a誘導(dǎo)較高量的p53通過(guò)激活其靶基因TSC2而抑制mTOR活性，使細(xì)胞進(jìn)入靜止期[17]。TSC2為p73的靶基因，盡管本研究未檢測(cè)TSC2的表達(dá)(將在下一步的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè))，但可推測(cè)2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a誘導(dǎo)p73α蛋白表達(dá)量較低，其靶基因TSC2的蛋白表達(dá)量也較低，不能完全抑制mTOR的活性，細(xì)胞進(jìn)入老化期。40.0～80.0 μmol/L的Nutlin-3a誘導(dǎo)p73α蛋白表達(dá)量較高，產(chǎn)生的TSC2較高，完全抑制mTOR活性，細(xì)胞進(jìn)入靜止期。靜止期的細(xì)胞在藥物撤除后恢復(fù)增生能力，使腫瘤復(fù)發(fā)。

綜上所述，Nutlin-3a通過(guò)阻斷MDM2與p73α的結(jié)合，解除MDM2對(duì)p73α的抑制作用，使p53基因突變型Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞中的p73α活性增強(qiáng)，以致p73α及其下游靶基因p21、Bax、Puma等的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、引起細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療腫瘤的目的。高濃度的Nutlin-3a引起腫瘤細(xì)胞顯著誘導(dǎo)死亡，但因誘導(dǎo)大量的 TSC2完全抑制mTOR的活性，使殘存的癌細(xì)胞處于靜止期，藥物撤除后恢復(fù)生長(zhǎng)，腫瘤復(fù)發(fā)。因此，使用Nutlin-3a治療腫瘤時(shí)，考慮其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制及殺傷作用的同時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮到其對(duì)殘存細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，只有在使用適當(dāng)?shù)乃幬餄舛缺苊忪o止期細(xì)胞殘存時(shí)才能對(duì)腫瘤起到根治作用。本研究表明在體外2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a對(duì)p53突變型結(jié)腸癌的治療作用最為理想。

本課題人員貢獻(xiàn)：鄔黎青與詹媛共同設(shè)計(jì)了本研究并共同完成Western blotting部分的實(shí)驗(yàn)及整理結(jié)果并撰寫(xiě)論文，為本研究做了等同的貢獻(xiàn)。王莉及陳玲共同完成了細(xì)胞培養(yǎng)及MTT實(shí)驗(yàn)以及所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陳小青及楊洋完成了衰老相關(guān)β-Gal染色實(shí)驗(yàn)。高歌及郝華完成了細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)。

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

(1)檢測(cè)Nutlin-3a對(duì)p53基因突變的結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2的作用。

(2)發(fā)現(xiàn)2.5～20.0 μmol/L的Nutlin-3a能明顯抑制Caco-2細(xì)胞，撤藥后殘存的細(xì)胞再生不明顯；殘存的細(xì)胞處于老化期；這個(gè)濃度范圍的Nutlin-3a是體外治療p53基因突變的結(jié)腸癌的最佳濃度。

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