蔡 偉，徐積兄，張 微，朱偉鋒，朱凌燕，劉 盈，肖鈞仁，劉建英

許多研究表明，晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥起著重要作用[1-3]。RAGE是一個(gè)多配體的細(xì)胞表面分子，屬于免疫球蛋白超家族。RAGE廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。而且，RAGE表達(dá)水平受高血糖等環(huán)境的影響，尤其是長(zhǎng)期高血糖所致大量晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)存在的條件下，RAGE呈高水平表達(dá)[1]。RAGE通過(guò)與其配體AGEs等相互作用，參與了糖尿病血管病變的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程[2-3]。本研究的前期研究及其他研究均發(fā)現(xiàn)，RAGE基因-429T/C多態(tài)性與中國(guó)漢族人糖尿病血管并發(fā)癥包括缺血性心臟病和腎病相關(guān)[4-5]。因而推測(cè)-429T/C多態(tài)性可能通過(guò)改變RAGE基因表達(dá)，從而影響RAGE在糖尿病血管并發(fā)癥中的作用。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)不同基因型的糖耐量正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)RAGE的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以初步了解RAGE基因-429T/C多態(tài)性對(duì)基因表達(dá)功能的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年8—12月在江西南昌地區(qū)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查人群中，選取70名糖耐量正常的漢族人群作為研究對(duì)象，均經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)篩查為糖耐量正常，排除糖尿病病史、高血壓病史、脂質(zhì)代謝紊亂史，無(wú)糖尿病家族史，而且血壓、血脂和肝腎功能均正常。最終匹配選取TT基因型組11名和TC基因型組11名。兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、血壓、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。本研究通過(guò)了南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，并取得了受試者的知情同意。

1.2 材料 DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，人單核細(xì)胞分離液購(gòu)自TBD公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)自Transgen公司，兔抗人RAGE抗體和羊抗兔-HRP購(gòu)自Santa Cruz公司，隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC提取與分離 抽取早晨空腹外周靜脈血2 ml，按1∶1體積加入Hank′s液混勻后，小心緩慢地在其液面上加入2 ml細(xì)胞分離液，以2 000 r/min(離心半徑145 mm)離心15 min，收集液界面上的細(xì)胞，放入含Hank′s液5 ml的試管中充分混勻后，以2 000 r/min(離心半徑145 mm)離心10 min，吸去上清液，沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次后，收集細(xì)胞備用。

1.3.2 基因型檢測(cè) 使用DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA，然后進(jìn)行目的基因片段的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物總長(zhǎng)為344 bp，上游引物：5′-GGGGGCAGTTCTCTCCTC-3′，下游引物：5′-TCAGAGCCCCCGATCCTATTT-3′。PCR反應(yīng)條件[5]：先預(yù)變性94 ℃ 10 min，繼之變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，接著每個(gè)循環(huán)的退火溫度依次下調(diào)0.5 ℃，共12個(gè)循環(huán)；其后變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃ 15 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行直接測(cè)序，以確定RAGE基因-429T/C多態(tài)性的基因型。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RAGE mRNA表達(dá)水平 提取各組總RNA(按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，核酸蛋白分析儀檢測(cè)含量。以隨機(jī)引物法合成cDNA，以cDNA為模板采用Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。RAGE引物序列上游引物：5′-GGGCTCTTCACACTGGC-3′，下游引物：5′-CTCCAGTACTACTCTCTGCCTGC-3′；Taqman探針序列為：5′-CGACAAGCACGCTTAGTTGACGGC 3′( 5′標(biāo)記為FAM，3′標(biāo)記為T(mén)AMRA)。GAPDH引物序列上游引物：5′-CAGTCAGCCGCATCTTCCTTT-3′,下游引物：5′-GTGACCACGGGCCAATAC-3′；Taqman探針序列為：5′-CGTCGCCAGCGGAGCCACA-3′(5′標(biāo)記為FAM，3′標(biāo)記為T(mén)AMRA)。采用Applied Biosystems公司7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并讀取試驗(yàn)數(shù)據(jù)。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。利用RAGE mRNA/GAPDH mRNA評(píng)定各標(biāo)本RAGE mRNA表達(dá)水平。

1.3.4 Western blotting法檢測(cè)RAGE蛋白表達(dá) 每個(gè)樣本PBMC加入細(xì)胞裂解液100 μl，在4 ℃溫度下裂解30 min，離心后取上清液進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定。配制8%分離膠與5%濃縮膠，上述每組蛋白取約30 μg加入等體積蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，隨后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，與特異性第一抗體(1∶200稀釋)、第二抗體(1∶1 000稀釋)結(jié)合，最后利用Luminol Reagent發(fā)光顯色。以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果以RAGE與GADPH光密度比值表示。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料比較

注：HbA1c=糖化血紅蛋白；*為χ2值

2 結(jié)果

2.1 個(gè)體樣本-429T/C多態(tài)性基因型檢測(cè)結(jié)果 對(duì)70名糖耐量正常的健康人進(jìn)行了DNA提取與PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得了個(gè)體的RAGE基因-429T/C多態(tài)性的基因型，包括TT基因型57名和TC基因型13名(見(jiàn)圖1)。

圖1 RAGE基因-429T/C多態(tài)性基因型測(cè)序圖

Figure1 The genotype sequencing graph of RAGE gene -429T/C polymorphism

2.2 兩組RAGE mRNA表達(dá)水平 隨機(jī)數(shù)字表法選取TC基因型組11名，采用性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、血壓、空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c相匹配的原則選擇TT基因型組11名。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TT基因型組RAGE mRNA表達(dá)水平(1.047±0.233)高于TC基因型組(0.740±0.209)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.42,P<0.05，見(jiàn)圖2)。

2.3 兩組RAGE蛋白表達(dá)水平 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，TT基因型組RAGE蛋白表達(dá)水平(1.121±0.252)高于TC基因型組(0.916±0.249)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.11,P<0.05,見(jiàn)圖3)。

3 討論

注：RAGE=晚期糖化終產(chǎn)物受體

圖2 兩組RAGE mRNA表達(dá)水平比較

Figure2 Comparison of RAGE mRNA expression levels between the two groups

圖3 兩組RAGE蛋白表達(dá)水平比較

在長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，糖尿病患者體內(nèi)大量的RAGE配體AGEs形成和堆積[6]。AGEs通過(guò)結(jié)合并激活RAGE，繼而激發(fā)一些關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑如MAP激酶(包括p38和p44/42 MAPK)和核因子кB(NF-кB)等，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，促使糖尿病患者出現(xiàn)血管病變?nèi)鐒?dòng)脈粥樣硬化、腎臟病變、視網(wǎng)膜病變等[3,7-8]。通過(guò)使用RAGE阻斷劑以及RAGE基因敲除，可明顯減緩或阻止糖尿病血管病變的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。而且有證據(jù)提示，RAGE 與AGEs的相互作用也是導(dǎo)致糖尿病“代謝不良記憶效應(yīng)”的重要原因之一[11-12]。由此可見(jiàn)，RAGE在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色。

本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)，RAGE基因-429T/C多態(tài)性與中國(guó)漢族人糖尿病腎病相關(guān)，而且攜帶-429C等位基因者糖尿病腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更低[5]。這與香港Poon等[4]的研究結(jié)果相似，其研究表明攜帶-429C等位基因的中國(guó)人糖尿病腎病患者缺血性心臟病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)更低。本研究檢測(cè)了-429T/C多態(tài)性不同基因型(TT基因型和TC基因型)的糖耐量正常人PBMC的RAGE表達(dá)情況，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型者RAGE mRNA和蛋白表達(dá)水平高于攜帶TC基因型者，從而提示-429C等位基因可能降低RAGE基因表達(dá)活性，進(jìn)一步支持-429C等位基因與糖尿病血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)。然而，也曾有研究提示，攜帶-429C等位基因的白種人糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，體外研究發(fā)現(xiàn)-429C等位基因和-374A等位基因明顯增強(qiáng)RAGE基因轉(zhuǎn)錄活性[13]。雖然造成以上結(jié)果的原因目前仍不明確，但目前認(rèn)為可能原因：RAGE基因存在著明顯的種族差異性，不同的種族人群研究可能得出不同的結(jié)果，例如有研究包括筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人RAGE基因-429T/C、 -374T/A和Gly82Ser多態(tài)性與白種人之間存在著明顯的種族差異性[14-15]；基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中影響因素較多，而且體外和體內(nèi)條件存在較大不同，因而得出的研究結(jié)果也可能不一致；RAGE在不同的環(huán)境下或在不同的組織細(xì)胞中所起的作用也存在差異。

總之，本研究結(jié)果提示，RAGE的遺傳變異性與RAGE基因表達(dá)相關(guān)，-429T/C多態(tài)性可能降低RAGE mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而支持其與糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)。由于本研究采用PBMC作為研究對(duì)象，而PBMC并不能完全模擬其他細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理生理狀況，因而所得出的研究結(jié)果存在一定局限性。因此，今后將進(jìn)行對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞等不同細(xì)胞的研究，以進(jìn)一步探討RAGE多態(tài)性的作用。

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