張馨文，叢金鵬，董 蕾，于文成

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展為特征，可以預(yù)防和治療的疾病[1-2]，常表現(xiàn)為氣道、肺實質(zhì)及血管的慢性炎癥。其中肺血管的慢性炎癥及其所引起的肺血管重塑被認為是COPD的基本病理特征之一，但其機制尚待闡明。近年有關(guān)Toll樣受體4(TLR-4)及骨形成蛋白2(BMP-2)在肺血管重塑中可能具有重要作用的報道多數(shù)來自動物模型[3-5]，但二者在COPD患者體內(nèi)表達情況及其作用的研究尚未見報道。本研究以COPD肺組織標本為材料，對其中TLR-4、BMP-2及平滑肌細胞增殖細胞核抗原(PCNA)的表達進行了檢測，并將其表達水平與肺血管重塑進行了相關(guān)性分析，為COPD的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源與處理 肺組織標本取自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科2012年7月—2013年7月住院需要手術(shù)治療的50例男性高分化肺鱗癌患者。根據(jù)是否患有COPD將患者分為COPD組和對照組，各25例。COPD診斷依據(jù)慢性阻塞性肺疾病診治標準[1]，且COPD患者均處于穩(wěn)定期，無其他肺部及其他系統(tǒng)性疾病。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)前肺功能測定，COPD組第1秒用力呼氣末容積占預(yù)計值百分比(FEV1%)、第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 兩組患者年齡和肺功能比較

注：FEV1%=第1秒用力呼氣末容積占預(yù)計值百分比；FEV1/FVC=第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比

1.2 標本處理 手術(shù)切除患者肺葉后，取遠離腫瘤部位5 cm以上未見浸潤的正常外周肺組織，石蠟包埋切片。所有標本的使用符合知情同意原則。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，選擇直徑為100～500 μm的動脈，半定量評價動脈壁及周圍炎性細胞浸潤程度。炎癥評分標準：無炎性細胞浸潤為0分；少許炎性細胞浸潤為1分；浸潤的炎性細胞較多但分布不均勻為2分；炎性細胞浸潤較多，分布均勻，但不聚集成團為3分；大量炎性細胞浸潤并聚集成團為4分。隨機選取橫斷面較圓且結(jié)構(gòu)完整的5條肺小動脈，Dotslide取像并測量肺小動脈管壁內(nèi)外徑及管壁厚度與管壁面積，計算管壁厚度占外徑百分比(WT%)和血管壁橫斷面積占血管總面積百分比(WA%)，取其平均值記為各組的血管重塑指標。

1.4 免疫組化染色法檢測TLR-4、BMP-2、PCNA 采用PV-6000二步法檢測TLR-4、BMP-2、PCNA，嚴格按照試劑盒(購自美國3M公司)說明書進行操作。每張切片在400倍視野下隨機采集5條直徑100～500 μm肺小動脈，請兩位有經(jīng)驗的病理專業(yè)醫(yī)師觀察同一血管壁橫斷面，計數(shù)并取其均值。TLR-4、BMP-2以細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒改變?yōu)殛栃员磉_，觀察計數(shù)肺動脈平滑肌細胞中TLR-4、BMP-2陽性細胞數(shù)占總平滑肌細胞數(shù)的百分比計為TLR-4、BMP-2表達水平；PCNA陽性反應(yīng)定位于細胞核，出現(xiàn)棕黃色顆粒則為增殖細胞，觀察計數(shù)PCNA陽性細胞占總平滑肌細胞數(shù)的百分比計為PCNA表達水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺血管炎性細胞浸潤及重塑程度比較 光學(xué)顯微鏡下COPD組肺血管管壁及周圍有大量單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，肺血管管壁明顯增厚，管腔狹窄，細胞間質(zhì)增多，出現(xiàn)肺血管重塑現(xiàn)象。COPD組患者炎癥評分、WT%、WA%均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table2 Comparison of inflammatory infiltration degree and vascular remodeling degree between the two groups

組別例數(shù)炎癥評分(分)WT%WA%對照組250 4±0 614 2±1 721 6±1 8COPD組251 6±0 827 8±3 435 7±3 0t值-6 278-17 624-19 942P值<0 01<0 01<0 01

注：WT%=管壁厚度占外徑百分比，WA%=血管壁橫斷面積占血管總面積百分比

2.2 兩組TLR-4、BMP-2及PCNA陽性表達水平比較 COPD組患者肺動脈血管平滑肌細胞TLR-4、BMP-2、PCNA表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3 COPD組TLR-4、BMP-2及PCNA表達水平與血管重塑相關(guān)性 COPD組患者肺動脈平滑肌細胞TLR-4、BMP-2水平與炎癥評分、WT%、WA%及PCNA水平均呈正相關(guān)，PCNA水平與WT%、WA%、炎癥評分均呈正相關(guān)(P<0.05,見表4)。

Table3 Comparison of the levels of expression of TLR-4，BMP-2 and PCNA between the two groups

組別例數(shù)TLR-4BMP-2PCNA對照組25 9 5±9 4 5 0±4 6 7 8±5 0 COPD組2529 3±16 030 9±21 328 3±12 7t值-5 344-6 099-7 522P值<0 01<0 01<0 01

注：TLR-4=Toll樣受體4，BMP-2=骨形成蛋白2，PCNA=增殖細胞核抗原

表4 COPD組TLR-4、BMP-2及PCNA表達水平與WT%、WA%、PCNA及炎癥評分的相關(guān)性(r值)

Table4 Correlation between the expression level of TLR-4,BMP-2，PCNA and WT%,WA%,PCNA，inflammation score in COPD group

TLR-4BMP-2PCNAWT%0 476?0 642?0 709?WA%0 622?0 550?0 713?PCNA0 322?0 558?-炎癥評分0 445?0 520?0 385?

注：*P<0.05；-為無此項

3 討論

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類天然免疫受體，可激活天然免疫、誘導(dǎo)獲得性免疫，其在COPD發(fā)病機制中的作用日益受到關(guān)注[6]。TLR-4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關(guān)蛋白，其主要識別革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)[7]。LPS進入肺臟后與TLR-4結(jié)合，產(chǎn)生多種促炎細胞因子的合成和釋放，引起肺部炎性反應(yīng)[8]。孟瑩等[3]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，在煙熏和脂多糖聯(lián)合煙熏所致肺部炎癥損傷大鼠中TLR-4的表達量較對照組明顯增加，指出TLR-4可能參與了大鼠肺部炎性反應(yīng)及COPD的形成。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的一員[9]，參與調(diào)節(jié)多種細胞增殖、分化、組織修復(fù)、炎性反應(yīng)、血管形成等作用[10]。BMP-2是這一家族的主要成員，其與受體結(jié)合后能調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡[11]。楊瑩等[5]實驗表明，慢性低氧可引起大鼠肺小動脈壁BMP-2表達的上調(diào)，證實BMP-2可能在低氧性肺血管重塑過程中發(fā)揮一定作用。

本研究表明，COPD組血管炎癥程度、血管重塑指標(WT%、WA%)明顯高于對照組，提示COPD血管存在炎性反應(yīng)，后者可能直接或間接誘導(dǎo)血管重塑的發(fā)生；而肺動脈平滑肌細胞TLR-4的表達與對照組相比明顯提高，且其表達水平與血管炎癥程度、血管重塑指標呈正相關(guān)，表明TLR-4參與了血管炎癥的發(fā)生，炎癥進一步引起了血管重塑，且與PCNA表達呈正相關(guān)。這一研究結(jié)果提示，TLR-4可能通過誘導(dǎo)肺動脈平滑肌的增殖，平滑肌的增生引起血管壁的增厚，管腔狹窄，引起肺血管重塑，繼而導(dǎo)致肺動脈高壓的產(chǎn)生。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，家族性肺動脈高壓及部分特發(fā)性肺動脈高壓的患者存在BMPR-Ⅱ的基因突變，由于BMP與BMPR-Ⅱ、BMPR-Ⅰ復(fù)合物形成缺陷，致使肺動脈平滑肌細胞增殖效應(yīng)增加，而凋亡作用減弱[12-13]。目前尚未有實驗證實BMPR-Ⅱ基因突變與COPD引起的低氧性肺動脈高壓有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，COPD組肺動脈平滑肌細胞BMP-2表達較對照組明顯升高，且與反映肺小動脈平滑肌細胞增殖的PCNA、與反映肺血管重塑程度的指標WT%、WA%及炎癥程度呈正相關(guān)。其機制可能在于，COPD患者長期的慢性低氧可引起血管BMP-2的上調(diào)，致使肺動脈平滑肌細胞增殖，并促進炎性反應(yīng)的發(fā)生，繼而造成肺血管重塑的形成，從而引起低氧性肺動脈高壓，這與家族性肺動脈高壓及部分特發(fā)性肺動脈高壓產(chǎn)生的機制不同。

總之，COPD患者肺血管平滑肌中TLR-4及BMP-2的表達水平增加，均能夠從促進炎性反應(yīng)及血管平滑肌細胞的增殖兩個途徑引起COPD患者血管重塑，進而促進肺動脈高壓的形成。因此，及時檢測TLR-4及BMP-2的表達水平，可能有助于COPD的早期診斷及其病情嚴重程度的觀察，這對防治COPD的進展、改善其預(yù)后等具有一定臨床意義。但本研究在應(yīng)用到臨床患者的治療中如發(fā)展靶向治療的方法，具有一定的局限性，故今后還有待進一步研究。

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