楊琳芬 饒輝 符金華 趙薇娜

（農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南昌），江西 南昌 330029）

液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬配合飼料中吉他霉素

楊琳芬 饒輝 符金華 趙薇娜

（農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南昌），江西 南昌 330029）

采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定豬配合飼料中吉他霉素。試樣中的吉他霉素經(jīng)20/80（V/V）甲醇/水提取，取部分上清液稀釋，用美國(guó)waters公司生產(chǎn)的固相萃取柱（6cc/200mgOasisHLB）凈化，氮?dú)獯蹈?，初始流?dòng)相復(fù)溶，上液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，保留時(shí)間和離子豐度比定性，外標(biāo)法定量。本方法中吉他霉素檢測(cè)限為0.01mg/kg、定量限為0.05mg/ kg。吉他霉素的線性范圍為5～200ng/mL，相關(guān)系數(shù)r大于0.999。在0.05～50mg/kg的添加水平上，吉他霉素的平均回收率為63.3%～106.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～10.3%。

液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法；豬配合飼料；吉他霉素

吉他霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和某些陰性菌、支原體、立克氏體、螺旋體等有效，主要用于抗青霉素的葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌感染。吉他霉素是豬配合飼料中常用的飼料藥物添加劑，防治慢性呼吸系統(tǒng)疾病，促進(jìn)生豬的生長(zhǎng)，提高生豬養(yǎng)殖效益。2001年農(nóng)業(yè)部第168號(hào)公告《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定，豬配合飼料中吉他霉素添加量：用于促進(jìn)生長(zhǎng)，5～55mg/kg；用于防治疾病，80～330mg/kg，連用5～7d，休藥期7d。為了防止飼料生產(chǎn)企業(yè)和生豬養(yǎng)殖戶在豬配合飼料中超量添加，違法使用，開展豬配合飼料中吉他霉素的測(cè)定意義重大。

1 原理

飼料中的吉他霉素經(jīng)甲醇水提取，OasisHLB純化，初始流動(dòng)相復(fù)溶，過0.45μm濾膜，上液質(zhì)測(cè)定，外標(biāo)法確證及篩查。

2 樣品制備

按照GB/T20195制備試樣，磨碎，全部通過0.28 mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中。

3 儀器設(shè)備

AB104-N電子天平、Agilent6410BQQQ液質(zhì)聯(lián)用儀、HITACHICRG離心機(jī)。

4 操作步驟

4.1 試樣提取

精確稱取試樣2g于250mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入20mL提取液（甲醇+水=20+80），振蕩30min，轉(zhuǎn)入離心管中，10000r/min離心5min，上清液備用。

4.2 樣品純化

固相萃取柱（6cc/200mgOasisHLB）分別用3 mL甲醇和3mL水活化，準(zhǔn)確移取5mL上清液過柱，清洗1：3mL5%甲醇及2%乙酸；清洗2：3mL5%甲醇及2%氨水；清洗3：3mL65%甲醇及2%氨水，近干后用甲醇洗脫，收集洗脫液。在氮吹裝置上50℃下用氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1mL初始流動(dòng)相（乙腈+0.1%甲酸水=90+10）復(fù)溶，過0.45μm微孔濾膜，上LC-MS/MS測(cè)定。上機(jī)液中的藥物濃度應(yīng)稀釋在線性范圍內(nèi)。

4.3 測(cè)定

4.3.1 液相色譜條件。色譜柱：AgilentZORBAXSBC182.1×100mm，1.8μm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫條件見表1。

4.3.2 質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM。使用前，應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量，以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。質(zhì)譜參數(shù)應(yīng)優(yōu)化至最佳。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰

撞能量的參考值見表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件min，%

表2 定性、定量離子對(duì)及碰撞能量的參考值m/z，V

4.3.3 定性測(cè)定。在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物的

保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，并且樣品圖譜中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近標(biāo)準(zhǔn)工作液中對(duì)應(yīng)的定性離子對(duì)的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，若偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。

4.3.4 定量測(cè)定。按照上述液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以色譜峰面積進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校正定量，樣品溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器規(guī)定的線性范圍內(nèi)。上述色譜和質(zhì)譜條件下，對(duì)照品的工作曲線圖、對(duì)照品的色譜質(zhì)譜圖和樣品的色譜質(zhì)譜圖見圖1～3。

圖1 吉他霉素液質(zhì)對(duì)照品的工作曲線圖

圖2 吉他霉素對(duì)照品的色譜質(zhì)譜圖

圖3 吉他霉素樣品的色譜質(zhì)譜圖

5 結(jié)果計(jì)算

試樣中某種待測(cè)物的含量X以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/ kg）表示，按式（1）計(jì)算。

式中：

m1—計(jì)算機(jī)外標(biāo)法自動(dòng)計(jì)算所得到的某待測(cè)物的質(zhì)量，單位為微克（μg）；

m—試樣質(zhì)量，單位為克（g）；

n—稀釋倍數(shù)。

測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

6 重復(fù)性

同一分析者對(duì)同一試樣同時(shí)兩次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差不大于20%。

7 結(jié)果分析

采用液質(zhì)聯(lián)用儀篩查確證豬配合飼料中吉他霉素等常用的飼料藥物添加劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳豬奶粉、乳豬人工乳、乳豬料、仔豬料和小豬料、中豬料、大豬料和生長(zhǎng)育肥豬后期料均含有吉他霉素。樣品純化應(yīng)采用美國(guó)waters公司生產(chǎn)的固相萃取柱（6cc/200mg OasisHLB），按優(yōu)化的OasisHLB程序進(jìn)行純化，這樣提取的上機(jī)液純度高，基質(zhì)干擾少。

1004-2342（2014）05-0013-02

S816.17

B

2014-07-31）