徐艷新，張偉國，葛向陽

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫214122)

黑曲霉產(chǎn)菊粉酶菌株的選育及培養(yǎng)基優(yōu)化

徐艷新，張偉國，葛向陽

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫214122)

為獲得高產(chǎn)菊粉酶的黑曲霉菌株，以AspergillusnigerYH-1為出發(fā)菌株,經(jīng)過亞硝基胍(NTG)誘變，以高溫高菊芋粉相結(jié)合的方式進(jìn)行梯度馴化，選育出一株產(chǎn)菊粉酶菌株YH-3，并運用響應(yīng)面實驗方法對該菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。確定了最佳培養(yǎng)基組成：菊芋粉25.2 g/L、豆餅粉40 g/L、蔗糖酯4.9 g/L、NaCl 5.5 g/L。發(fā)現(xiàn)內(nèi)切菊粉酶活力(I)由60.9 U/mL提高到165.0 U/mL，比出發(fā)菌株提高了1.7倍。研究證明蔗糖酯對于黑曲霉YH-3發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶是一種有效的促進(jìn)劑。

黑曲霉；馴化；菊粉酶；誘變；響應(yīng)面

菊芋是菊科(Compositae)向日葵屬中能形成地下塊莖的栽培種，地下塊莖含有豐富的菊粉，約占菊芋肥大塊莖干質(zhì)量的70%以上[1]。菊粉(inulin)是一種菊糖型果聚糖，分子由D-呋喃果糖通過β-1,2糖苷鍵相連，還原端接一個葡萄糖殘基，呈直鏈結(jié)構(gòu)，聚合度為2～60，相對分子質(zhì)量在3 500～5 500之間[1-2]。

菊粉酶按其作用方式不同分為內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶，分別用I和S表示，I/S越大，表明內(nèi)切菊粉酶活力越大；反之則表明外切菊粉酶活力越大[3]。內(nèi)切菊粉酶隨機(jī)地切斷菊粉鏈內(nèi)部的糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是低聚果糖；外切菊粉酶作用于菊粉鏈的非還原性末端的糖苷鍵，逐一切斷糖苷鍵，主要產(chǎn)物是果糖。經(jīng)菊粉酶酶解得到的低聚果糖和果糖，由于具有多種優(yōu)良的生理功能而備受關(guān)注[4]。目前，利用菊粉生產(chǎn)低聚果糖或果糖的瓶頸是菊粉酶活性不高。為此，進(jìn)一步提高菊粉酶活力引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[5]。

筆者對一株產(chǎn)菊粉酶的黑曲霉菌株進(jìn)行亞硝基胍誘變，以高溫高菊芋粉相結(jié)合的方式進(jìn)行梯度馴化，選育出一株產(chǎn)菊粉酶發(fā)酵活力較強(qiáng)的菌株，并對影響產(chǎn)酶的顯著因素進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，以期得到較高的菊粉酶活力。

1 材料與方法

1.1 菌株

黑曲霉菌株YH-1 (AspergillusnigerYH-1)，由筆者所在實驗室分離并保藏。

1.2 試劑

菊芋粉(自制)：將洗凈去皮的鮮菊芋切片，60 ℃烘干，使水分降至5%左右，粉碎過450 μm篩；蛋白胨、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4·7H2O、蔗糖酯、菊糖、蔗糖均為分析純。

1.3 儀器

立式圓形壓力蒸氣滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；全溫?fù)u床柜，太倉市常樂實驗設(shè)備廠；UV-2100型可見紫外分光光度計，上海尤尼克有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司；升降恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司；分析天平，上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，土豆200，瓊脂20。

菊芋粉平板培養(yǎng)基(g/L)：菊芋粉(100、120、140、160、180、200、220、250)，瓊脂20；pH自然，121 ℃滅菌20 min。

馴化培養(yǎng)基(g/L)：菊芋粉(梯度質(zhì)量濃度分別為180、200)，瓊脂20；pH自然，裝液量50 mL/250 mL，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：菊芋粉40、豆餅粉50、MnSO40.3、NaCl 0.8、MgSO4·7H2O 0.5、蔗糖酯3；pH自然，裝液量100 mL/500 mL，115 ℃滅菌10 min。

1.5 酶活力測定方法

測量方法參照Pessoni等[6]和周杰民等[7]的報道略有改進(jìn):內(nèi)切菊粉酶酶活力的測定：取20 g/L菊糖溶液0.4 mL(pH 4.6、0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制)加入到25 mL具塞試管中，并于50 ℃水浴平衡5 min，再加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，50 ℃水浴反應(yīng)30 min，最后加入0.5 mL DNS終止反應(yīng)。沸水浴5 min，待冷卻后定容至10 mL，550 nm比色，測定反應(yīng)體系中還原糖量。在相同條件下，加入滅活的粗酶液0.1 mL作為對照。在上述條件下，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量為一個酶活力單位(U)，用I表示。

外切菊粉酶酶活力的測定：以20 g/mL蔗糖溶液0.4 mL代替菊糖溶液，其他步驟同上。以每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量為一個酶活單位(U)，用S表示。

1.6 誘變方法

1.6.1 單孢子懸液的制備

黑曲霉斜面培養(yǎng)3 d，制成孢子懸液，經(jīng)無菌濾紙過濾，適當(dāng)稀釋后得到密度為106個/mL單孢子懸液。

1.6.2 亞硝基胍(NTG)誘變

吸取1 mg/mL的NTG溶液1 mL加入到裝有2 mL單孢子懸液的碘量瓶中，30 ℃下振蕩反應(yīng)一定的時間，離心沉降，棄去上清液，用無菌生理鹽水懸浮，適當(dāng)稀釋后涂布于篩選平板。

1.7 篩選方法

1.7.1 初篩

將誘變后的孢子懸液適當(dāng)稀釋，涂布于菊芋粉質(zhì)量濃度為100 g/L篩選平板,30 ℃培養(yǎng)72 h，挑選出R值(R=T/J，T為透明圈直徑，J為菌落直徑)較大的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基保藏[8]。

1.7.2 復(fù)篩

將初篩得到的菌株先進(jìn)行種子液培養(yǎng)，然后每株菌分別按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)120 h，篩選出產(chǎn)酶最高的菌株YH-2。

1.8 馴化

首先對菌株YH-2進(jìn)行溫度和菊芋粉濃度的耐受極限研究，確定馴化的起始溫度和菊芋粉濃度。然后對菌株進(jìn)行高溫高菊芋粉相結(jié)合的梯度馴化，使其在極端環(huán)境下能夠生長，提高產(chǎn)酶活力。最后，將馴化后的菌株經(jīng)初篩復(fù)篩得到一株產(chǎn)酶菌株YH-3，并檢驗該菌株對溫度和菊芋粉濃度的耐受性。

1.9 響應(yīng)面(RSM)實驗設(shè)計

由單因素實驗確定了豆餅粉添加量為40 g/L,MnSO4、MgSO4·7H2O幾乎不影響產(chǎn)酶量，因此添加量為0，對產(chǎn)酶影響顯著的3個因素為：菊芋粉、蔗糖酯和NaCl。根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)中心組合實驗設(shè)計原理[9-10]，以影響產(chǎn)酶顯著的三因素A(菊芋粉)、B(蔗糖酯)和C(NaCl)為自變量，以內(nèi)切菊粉酶活力(I)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的BBD實驗，實驗因素和水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硝基胍誘變

以實驗室保藏的黑曲霉YH-1(I/S=0.38)為出發(fā)菌株，進(jìn)行亞硝基胍誘變，經(jīng)過初篩、復(fù)篩得到一株產(chǎn)酶菌株YH-1-52，重新命名為YH-2，發(fā)現(xiàn)內(nèi)切菊粉酶活力(I)由60.9 U/mL提高到77.4 U/mL，比出發(fā)菌株YH-1提高了27%，誘變篩選結(jié)果見表2。

由表2可知，誘變前后I/S比值基本不變。表明傳統(tǒng)的誘變方法不能夠改變黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的特性，這與王靜等[3]的誘變結(jié)果相似。

2.2 耐高溫及耐高菊芋粉馴化的結(jié)果

2.2.1 YH-2高溫高菊芋粉相結(jié)合的梯度馴化

菊粉酶是一種誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，菊芋粉既是誘導(dǎo)物又是比較理想的C源。在發(fā)酵初期，菌體將菊芋粉分解為還原糖，其后又利用還原糖滿足其生長需要，所以菊粉酶的產(chǎn)量會隨著菊芋粉濃度增大而提高。但菊芋粉濃度太高，菊芋粉中含有的少量還原糖會使發(fā)酵培養(yǎng)基中還原糖總量增加，以及發(fā)酵過程中分解得到的還原糖量的增加，都會抑制菌種產(chǎn)酶[3]。高溫發(fā)酵可以抑制雜菌生長，而且，較高的溫度可以誘導(dǎo)孢子萌發(fā)[11]，刺激菌體迅速生長，對產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。因此采用高溫高菊芋粉相結(jié)合的馴化思路，以期獲得產(chǎn)酶較高的菌株[12]。

表2 NTG誘變結(jié)果Table 2 Results of NTG treatment

首先對NTG誘變得到的菌株YH-2進(jìn)行耐菊芋粉性能和耐高溫性能的研究，確定了菌株YH-2對菊芋粉和溫度的耐受極限分別是180 g/L和39 ℃，所以馴化以180 g/L和39 ℃為起始梯度。吸取適量的YH-2的孢子懸液接種于菊芋粉質(zhì)量濃度為180 g/L的馴化培養(yǎng)基，39 ℃培養(yǎng)32 h，反復(fù)馴化5次。接著接種于菊芋粉質(zhì)量濃度為200 g/L的馴化培養(yǎng)基，41 ℃培養(yǎng)32 h，反復(fù)馴化5次，具體步驟見表3。將最后得到的孢子液適當(dāng)?shù)南♂?，?jīng)過初篩，復(fù)篩選育出一株產(chǎn)酶菌株YH-2-60，重新命名為YH-3，結(jié)果見表4。

表3 馴化培養(yǎng)條件Table 3 Training conditions of domestication

表4 馴化選育結(jié)果Table 4 Results of acclimatization and screening

由表4可知，YH-3內(nèi)切菊粉酶活力(I)由77.4 U/mL提高到85.2 U/mL，比YH-2提高了10%，I/S保持不變。該結(jié)果表明，高溫高菊芋粉相結(jié)合的梯度馴化方法，對于提高菊粉酶的產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。2.2.2 馴化前后菌株對菊芋粉和溫度耐受性的對比

將馴化前后的菌株YH-2、YH-3進(jìn)行耐菊芋粉性能和耐高溫性能的對比。制備孢子懸液并適當(dāng)稀釋，分別涂布到不同濃度的菊芋粉平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，以菌體的生長狀況表征對菊芋粉的耐受性，結(jié)果見表5。

表5 YH-2、YH-3對菊芋粉的耐受性Table 5 Tolerability of YH-2 and YH-3 to Jerusalem artichoke powder

注：++生長較好，+-微弱生長，-不生長。

將孢子懸液涂布到菊芋粉質(zhì)量濃度為100 g/L的平板，分別放在不同的溫度下培養(yǎng)3 d，以菌體的生長狀況表征對溫度的耐受性，結(jié)果見表6。

表6 YH-2、YH-3對溫度的耐受性Table 6 Tolerability of YH-2 and YH-3 to temperature

注：++生長較好，+-微弱生長，-不生長。

經(jīng)過高溫、高菊芋粉相結(jié)合的梯度馴化，菌株的耐高溫耐菊芋粉的能力都得到了相應(yīng)的提高。由表5可知，YH-2菌株對菊芋粉的耐受臨界濃度為180 g/L，超過此濃度已不能生長。YH-3在高于220 g/L時菌株不能生長。馴化前后菌株對菊芋粉的耐受濃度由180 g/L提高到220 g/L。

由表6可知，YH-2對溫度的耐受臨界值為39 ℃，超過此溫度菌株不能生長。YH-3在高于41 ℃時菌株不能生長。馴化前后菌株對溫度的耐受性由39 ℃提高到41 ℃。

2.3 菌株選育譜系

菌株選育譜見圖1。

圖1 YH-1選育譜系Fig.1 Breeding process of YH-1

2.4 菌株YH-3的遺傳穩(wěn)定性

將最終篩選出的菌株A.nigerYH-3進(jìn)行多次分離純化，并斜面保藏。平板連續(xù)傳代10次，在相同培養(yǎng)條件下，產(chǎn)酶結(jié)果見表7，結(jié)果表明該株菌遺傳特性穩(wěn)定。

2.5 蔗糖酯對黑曲霉產(chǎn)酶的影響

蔗糖酯，是由蔗糖通過酯鍵與硬脂酸共價鍵鏈接[13]。該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中含有親水性的蔗糖基團(tuán)和疏水性的脂肪酸基團(tuán)，在水溶液中成球形的分子排布，具有很強(qiáng)的表面活性，更有利于靠近并吸附在真菌菌絲體的表面，作為持續(xù)的刺激信號促進(jìn)細(xì)胞不斷地合成以用于生產(chǎn)菊粉酶的mRNA，從而有效地促進(jìn)菊粉酶的生成[14]。

表7 YH-3的遺傳穩(wěn)定性實驗Table 7 Genetic stability of YH-3

由單因素實驗確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖酯的最佳添加量為5 g/L。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5 g/L的蔗糖酯，經(jīng)過100 h發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在添加了蔗糖酯的培養(yǎng)基中菊粉酶活力達(dá)到最大值137 U/mL，而沒有添加蔗糖酯的培養(yǎng)基中，菊粉酶活力僅達(dá)到85.2 U/mL。這表明蔗糖酯對于發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶是一種有效的促進(jìn)劑，結(jié)果見圖2。

圖2 蔗糖酯對發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶的影響Fig.2 Effects of sucrose ester on the inulinase fermentation production

由圖2可知：在0～60 h，以菌絲體生長為主，對照和添加蔗糖酯沒有明顯的差異。從60 h開始菌體以產(chǎn)酶為主，尤其是80 h以后，蔗糖酯對于黑曲霉產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，100 h菊粉酶的產(chǎn)量達(dá)到了頂峰。

2.6 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

實驗中使用Box-Behnken Design法對影響菊粉酶發(fā)酵的3個關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化，不同因素的水平值和實驗結(jié)果見表8，并利用Design Expert軟件對模型的適應(yīng)性進(jìn)行了方差分析檢驗，結(jié)果見表9。

由表9可知，模型的F值為46.53，P(Prob>F)值為0.000 3，比較顯著，且失擬檢驗不顯著(P=0.265 1)。擬合系數(shù)(R2)為0.988 2，表明觀察值與預(yù)測值之間相關(guān)性較好。模型的矯正系數(shù)(AdjR-Squared)0.967 0與PredR-Squared 0.841 3值較接近，說明實驗的預(yù)測值在可信區(qū)間內(nèi)。模型的精密度(Adeq Precision)為20.567>4，說明實驗的精度較高。綜上分析可知，該模型與實際情況擬合較好，可用于預(yù)測菊粉酶的發(fā)酵情況。

對實驗結(jié)果多次回歸分析得出內(nèi)切菊粉酶活力對菊芋粉、蔗糖酯及NaCl的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程

Y=163.70+2.32A+19.47B+8.03C-6.17AB+2.38AC-0.18BC-28.26A2-32.91B2-24.91C2

Y為內(nèi)切菊粉酶活力(I)的預(yù)測值，A、B、C為上述3個自變量的編碼值。這3個因素對發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶的影響順序依次是B、C、A，此外，A2、B2和C2對菊粉酶的產(chǎn)量也有顯著影響，A和B交互作用最為明顯。這是因為蔗糖酯既可以作為誘導(dǎo)劑又可以作為表面活性劑，能夠有效增大菌體細(xì)胞和菊粉酶與菊芋粉之間的接觸，從而可以顯著促進(jìn)黑曲霉的產(chǎn)酶水平。這些因素之間的響應(yīng)面圖及對應(yīng)的等高線圖如圖3～圖5所示。

表8 響應(yīng)面設(shè)計方案和實驗結(jié)果Table 8 Results of response surface experiments

表9 回歸模型方差分析Table 9 Analysis of variance for regression model

注：R2=0.988 2，C.V.=4.51%。

圖3 菊芋粉(A)與蔗糖酯(B)對內(nèi)切菊粉酶活力合成的影響Fig.3 Effects of Jerusalem artichoke flour and sucrose ester on inulinase production

圖4 菊芋粉(A)與NaCl(C)對內(nèi)切菊粉酶活力合成的影響Fig.4 Effects of Jerusalem artichoke flour and NaCl on inulinase production

圖5 蔗糖酯(B)與NaCl(C)對內(nèi)切菊粉酶活力合成的影響Fig.5 Effects of sucrose este and NaCl on inulinase production

由圖3～5可知，回歸模型存在穩(wěn)定點即最大值，將二次回歸方程分別對因素A、B、C求偏導(dǎo)，令導(dǎo)數(shù)等于0，得出3個因素的最佳值為A=0.016，B=0.294，C=0.160，Y=167.2。換算成真實濃度：菊芋粉25.2 g/L、蔗糖酯4.9 g/L、NaCl 5.5 g/L，內(nèi)切菊粉酶活力(I)的預(yù)測值為167.2 U/mL，I/S=0.39。采用三因素的最佳值，進(jìn)行3次發(fā)酵驗證實驗測得內(nèi)切菊粉酶活力(I)為165.0 U/mL，I/S=0.39，與預(yù)測值接近。表明預(yù)測值與實驗值之間有較好的擬合性，模型可信度較高。

3 結(jié) 論

對1株產(chǎn)菊粉酶的A.nigerYH-1進(jìn)行DES誘變，經(jīng)過初篩復(fù)篩，最終得到一株產(chǎn)菊粉酶菌株YH-2發(fā)現(xiàn)，內(nèi)切菊粉酶活力由最初的60.9 U/mL提高到77.4 U/mL，比出發(fā)菌株提高了27%，誘變前后I/S=0.39沒有變化。接著對YH-2進(jìn)行了高溫高菊芋粉相結(jié)合的梯度馴化，經(jīng)過篩選得到一株產(chǎn)菊粉酶的菌株YH-3，內(nèi)切菊粉酶活力由77.4 U/mL提高到85.2 U/mL，比YH-2提高了10%。實驗中發(fā)現(xiàn)蔗糖酯對于黑曲霉YH-3發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶是一種有效的促進(jìn)劑。最后對產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基組成：菊芋粉25.2 g/L、豆餅粉40 g/L、蔗糖酯4.9 g/L，NaCl 5.5 g/L。發(fā)現(xiàn)內(nèi)切菊粉酶活力可達(dá)165 U/mL，I/S=0.39，比出發(fā)菌株提高了1.7倍。

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

Breeding of Aspergillus niger strain for producing inulinase andoptimization of culture medium

XU Yanxin,ZHANG Weiguo,GE Xiangyang

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In order to acquire a high-yieldAspergillusnigerstrain for producing inulinase,the original strainAspergillusnigerYH-1 was treated withN-methyl-N′-nitro-soguanidine (NTG) and domesticated by combining high temperature andJerusalemartichokepowder,a inulinase production strain YH-3 was selected.The culture medium of YH-3 was optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum culture medium components were determined:Jerusalemartichokeflour 25.2 g/L,soybean cake powder 40 g/L,sucrose ester 4.9 g/L and NaCl 5.5 g/L.Under the optimum conditions,the yield of inulinase was increased from 60.9 U/mL to 165.0 U/mL,increased 1.7 times compared with the starting strain.The research proved that sucrose ester was an effective accelerator forAspergillusnigerYH-3 producting inulinase.

:Aspergillusniger;domestication;inulinase;mutation;response surface methodology

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.004

2012-07-08

中國博士后科學(xué)基金(20110491368)

徐艷新(1987—)，女，山東聊城人，碩士研究生，研究方向：菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化；張偉國(聯(lián)系人)，教授，E-mail：zhangwg186@163.com

Q556+.2

A

1672-3678(2014)02-0017-07