張建芬，余翠君，陶偉峰

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州310015)

白蟻腸道內(nèi)纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶活性

張建芬，余翠君，陶偉峰

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州310015)

從黑翅土白蟻(OdontotermesformosanusShiraki)腸道內(nèi)篩選具有纖維素降解能力的細(xì)菌，并研究其酶活性。結(jié)果表明：篩選得到5株菌株，活力較高的菌株CMC-4被鑒定為土白蟻特拉布爾希氏菌Z-4(TrabulsiellaodontotermitisZJSRU-4)。同時對菌株T.odontotermitisZJSRU-4進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，它具有完整的纖維素酶系統(tǒng)，主要產(chǎn)羧甲基纖維素酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶，濾紙酶的活力較低。在以羧甲基纖維素鈉為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液中CMCase的比酶活達(dá)到20.8 U/mL，培養(yǎng)44 h，β-糖苷酶的比酶活達(dá)到18.2 U/mL。CMCase和β-葡萄糖苷酶作用的pH分別為6.0和6.5，它們作用的最適溫度都為40 ℃。該菌對纖維質(zhì)原料具有降解能力，具有潛在的應(yīng)用價值。

白蟻；纖維素降解菌；篩選；羧甲基纖維素酶；土白蟻特拉布爾希氏菌

纖維素是地球上年產(chǎn)量巨大，而一直未能得到充分利用的可再生性的多糖類有機(jī)物資源。如何將纖維素物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為有用的糖和乙醇等是研究人員一直探索的課題。已知產(chǎn)纖維素酶的生物很多,如細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物及白蟻、蝸牛等動物[1]。白蟻是熱帶和亞熱帶地區(qū)木質(zhì)纖維素的重要分解者，它對地球陸地生態(tài)系統(tǒng)的形成起到了巨大的作用[2-3]。在白蟻的后腸中，有大量的共生微生物定居。后腸微生物對白蟻的生命活動具有重要作用，白蟻所需的營養(yǎng)物質(zhì)大多來自微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，后腸中的微生物發(fā)酵纖維素類物質(zhì)生成乙酸、丙酸以及其他有機(jī)酸，是白蟻重要的能源和自身物質(zhì)合成的碳架重要來源[4]。目前從白蟻中分離到的具有纖維素酶活的細(xì)菌有芽孢桿菌(Bacillus)[5-6]、螺旋菌(Spirochaeta)[7]、鏈霉菌(Streptomyces)[8]、葡萄球菌(Streptococcus)[9]和貪噬菌(Variovorax)[10]。黑翅土白蟻(OdontotermesformosanusShiraki)在我國分布廣泛,是社會危害性最大的低等白蟻之一。本文從黑翅土白蟻(OdontotermesformosanusShiraki)腸道中分離具有降解纖維素能力的細(xì)菌，并研究其酶學(xué)性質(zhì)，以期為纖維素降解菌的生產(chǎn)與研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白蟻的來源

采集杭州北高峰山林的白蟻樣品(黑翅土白蟻，OdontotermesformosanusShiraki)，作為菌種篩選來源。選取體型健壯的工蟻，解剖后制備白蟻后腸菌懸液。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

富集培養(yǎng)基：KH2PO42 g，MgSO40.15 g，KNO31 g，CMC-Na 10 g，定容至1 L，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。

選擇培養(yǎng)基：牛肉浸膏1.5 g，蛋白胨5 g，CMC-Na 1 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，定容至1 L，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，酵母粉 2 g，KH2PO42 g，MgSO40.15 g定容至1 L，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。

細(xì)菌基因組提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品,Taq酶購自TaKaRa公司,引物合成及PCR 產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 白蟻腸道纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

1.3.1 解剖白蟻及白蟻后腸菌懸液制備

選取2頭工蟻，置冰上微冷凍使其活動性減弱，用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精對白蟻表面進(jìn)行消毒,再用蒸餾水洗3次，待用。白蟻解剖及后腸菌懸液的制備參見文獻(xiàn)[10]。

1.3.2 纖維素酶產(chǎn)生菌的富集培養(yǎng)

取白蟻后腸菌懸液5 mL轉(zhuǎn)入無菌試管中，于30 ℃下振蕩培養(yǎng)1～3 d后，按2%的接種量，轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行第2次富集培養(yǎng)。

1.3.3 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

將富集培養(yǎng)后的菌液做平板稀釋涂布法分離，待長出單菌落后，用牙簽點(diǎn)種在選擇平板上，剛果紅染色[8-9]觀察。

挑取透明圈較大的菌落,進(jìn)行多次劃線分離，并進(jìn)行牙簽點(diǎn)種和剛果紅染色，觀察透明圈的大小，直至得到穩(wěn)定降解纖維素的純克隆。

1.4 菌種的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)研究

將篩選所得菌株經(jīng)多次劃線分離后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、簡單染色觀察及革蘭氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

按試劑盒規(guī)定方法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增16S rDNA基因。采用通用引物8F(5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′)和1492R (5′-A￣C￣G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′)，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL(引物各為0.3 μL，Taq酶體系為12.5 μL,DNA模板為0.2 μL，ddH2O為11.7 μL)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，再將PCR的反應(yīng)產(chǎn)物交由上海生工生物工程公司完成測序分析。序列測序驗(yàn)證后提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST相似性比較，MEGA 5軟件鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 纖維素酶活力測定方法

纖維素酶活力的測定采用3，5-硝基水楊酸(DNS)法[11]。

酶活力單位定義：在 pH 6.5、40 ℃ 條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.6 粗酶液的制備

100 mL發(fā)酵液離心得到3 g濕菌體，收集上清液。將上清液在冰浴條件下加入固體(NH4)2SO4至飽和度80%。4 ℃下靜置30 min，離心(10 000 r/min)10 min，收集沉淀，用少量Tris-HCl緩沖液(pH 7.0，20 mmol/L)溶解。將鹽析酶液用Tris-HCl緩沖液(pH 7.0，20 mmol/L)透析過夜，得到的酶液即為粗酶液Ⅰ。菌體用生理鹽水洗滌2次后，用pH 7.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液20 mL懸浮。在冰浴中超聲波破壁10 min(300 W，5 s，間隔10 s)，4 ℃下抽提30 min。離心，取上清液即為粗酶液Ⅱ。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)研究

研究部分純化的酶液的酶學(xué)性質(zhì)，包括不同底物、溫度、pH等，得出最優(yōu)的纖維素酶反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選與純化

經(jīng)富集培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基平板篩選、多次劃線分離后篩選得到5株能以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為唯一C源生長的菌株CMC-4、CMC-5、CMC -11、CMC -16和CMC -17，這些菌株經(jīng)剛果紅染色后在菌落周圍都出現(xiàn)明顯透明圈(圖1)。

圖1 菌株的剛果紅染色Fig.1 Congo red staining of strain

分別測量剛果紅染色后水解圈的直徑及菌落直徑，它們的比值即為HC值，結(jié)果如表1所示。由表1可知：菌株CMC-5纖維素降解圈直徑與菌落直徑的比值為3.40。說明該菌株具有較高的CMCase活性。

表1 纖維素分解菌剛果紅染色的透明水解圈

2.2 纖維素酶產(chǎn)生菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定

對HC值較大的菌株CMC-4、CMC-5進(jìn)行鑒定，它們的外觀比較一致，為無芽孢的桿狀細(xì)菌，在固體營養(yǎng)瓊脂上形成乳白色、光滑、透亮的、半透明的、運(yùn)動的、邊緣不規(guī)則的菌落，進(jìn)一步生化分析這2株菌為兼性好氧，革蘭氏陰性細(xì)菌。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步確定篩選到的菌株CMC-4、CMC-5的分類地位，在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。圖2為16S rDNA的PCR凝膠電泳結(jié)果。由圖2可知，PCR擴(kuò)增分別得到約1.5 kb長的片段。

1—標(biāo)準(zhǔn)DNA；2—CMC-4菌的PCR；3—CMC-5菌的PCR圖2 菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增片段Fig.2 PCR fragments of 16S rDNA of strain

通過16S rDNA基因(圖2)序列分析和進(jìn)化樹分析(圖3)。由圖3可知，CMC-4和CMC-5與TrabulsiellaodontotermitiesEant 3-9(DQ453129) 的相似度為99%。因此，菌株CMC-4和CMC-5為同一株菌，命名為土白蟻特拉布爾希氏菌ZJSRU-4(TrabulsiellaodontotermitiesZJSRU-4)，將該菌株16S rDNA基因序列(1 452 bp)登陸GenBank，獲得登錄號為KC633946。T.odontotermitisEant 3-9T和 Eant 3-3為2007年從臺灣南部屏東縣腐爛的竹子上聚集的黑翅土白蟻(O.formosanusShiraki)的腸道內(nèi)首次分離到的菌株[12]。迄今為止，還沒有此菌被發(fā)現(xiàn)的其他報道。本文篩選到的T.odontotermitisZ-4是從杭州北高峰腐爛的松樹上聚集的黑翅土白蟻的腸道內(nèi)分離得到。由此推斷，T.odontotermitis可能存在于熱帶和亞熱帶土白蟻的腸道內(nèi)。

圖3 菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of isolated strain

2.3 產(chǎn)酶分析

圖4 粗酶液對不同底物的酶活力比較Fig.4 Enzyme activity of crude enzyme solution on different substrate

為了鑒定菌株ZJSRU-4所產(chǎn)的纖維素酶系統(tǒng)，濾紙、水楊苷和CMC-Na分別作為粗酶液Ⅰ和粗酶液Ⅱ酶反應(yīng)的底物，鑒定結(jié)果見圖 4。由圖4可知：當(dāng)濾紙、水楊苷和CMC-Na分別作為酶反應(yīng)的底物時，粗酶液Ⅰ和粗酶液Ⅱ的反應(yīng)體系都能檢測到少量葡萄糖的生成。粗酶液Ⅰ，即胞外酶液主要為CMCase，而粗酶液Ⅱ，即胞內(nèi)酶液主要為β-糖苷酶。說明菌株ZJSRU-4具有完整的纖維素酶系統(tǒng)。纖維素酶系統(tǒng)包括C1 纖維素酶,CMCase和β-糖苷酶，只有它們的協(xié)同作用，才能把纖維素降解為葡萄糖[13]。因?yàn)闉V紙酶酶活力較低，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，筆者僅研究粗酶液Ⅰ中CMCase的酶學(xué)性質(zhì)和粗酶液Ⅱ中β-糖苷酶的酶活力。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

測定菌株經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)的CMCase和β-糖苷酶的比酶活，結(jié)果見圖5。由圖5可知：在36 h CMCase的酶活力均達(dá)到最大，達(dá)到20.8 U/mL發(fā)酵液；培養(yǎng)44 h，β-糖苷酶的比酶活力到18.2 U/mL發(fā)酵液。綜合考慮2種酶的酶活力，在以下試驗(yàn)中，均以培養(yǎng)40 h的發(fā)酵液測定CMCase和β-糖苷酶的比酶活。

圖5 菌株ZJSRU-4的產(chǎn)酶曲線Fig.5 Enzyme activity of strain ZJSRU-4 during culture time

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 pH和溫度對纖維素酶活性的影響

為了研究pH對CMCase和β-糖苷酶的酶活力的影響，反應(yīng)體系選用50 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 4.0～5.8)，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 5.8～8.0)和50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.0～9.0)。緩沖體系對CMCase的影響較大，同一pH條件下，Tris-HCl緩沖體系比甘氨酸-NaOH緩沖體系酶活力更高。pH對CMCase和β-糖苷酶的酶活力的影響均較大，最適pH分別在6.5和6.0附近(圖6(a))。考察CMCase和β-糖苷酶在不同溫度(20、25、30、35、40、 45、50、55和60 ℃)下的比酶活變化，結(jié)果見圖6(b)。由圖6(b)可知：CMCase和β-糖苷酶的最適反應(yīng)溫度均為40 ℃。據(jù)文獻(xiàn)[14-16]報道，多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)的CMCase的最適反應(yīng)溫度在40～65 ℃，最適反應(yīng)pH在5.4～7.0[14-16]，說明筆者分離到的CMCase與文獻(xiàn)報道的一致。

圖6 溫度和pH對CMCase和β-糖苷酶的影響Fig.6 Effects of pH and temperature on CMCase and β-glucosidase activity

2.5.2 CMCase對不同纖維素材料的降解能力

將菌株分別接種到不同纖維素材料的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別測定CMCase的酶活以顯示其對不同纖維素材料的降解能力，結(jié)果見圖7。由圖7可知：菌株對CMC-Na的降解活力較高，對新華濾紙、玉米秸稈、水稻秸稈和小麥麩皮均有降解能力，但酶活力不高。說明菌株T.odontotermities對纖維質(zhì)原料具有降解能力，具有潛在的應(yīng)用價值。

圖7 菌株對不同纖維素材料的降解能力Fig.7 Cellulose-degrading ability of strain ZJSRU-4 under different carbon source

3 結(jié) 論

從白蟻腸道中分離得到5株具有纖維素降解活力的菌株，活力較高的菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定為土白蟻特拉布爾希氏菌ZJSRU-4(TrabulsiellaodontotermitisZJSRU-4)、對該菌株進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。菌株T.odontotermitisZJSRU-4能產(chǎn)生較高的CMCase的酶活力和β-糖苷酶活力，濾紙酶活力較低，說明該菌株能實(shí)現(xiàn)纖維素的協(xié)同降解。菌株ZJSRU-4具有完整的纖維素酶系統(tǒng)，許多植物材料的主要成分如秸稈、玉米秸稈、小麥麩皮等能被該菌降解，雖然目前降解活力并不高。在以后的研究中，可以進(jìn)一步研究其培養(yǎng)條件以提高纖維素酶活力，或者通過混菌培養(yǎng)以提高降解活力。在后續(xù)的研究工作中，將擬分離純化來源于T.odontotermitisZJSRU-4的CMCase，濾紙酶和β-糖苷酶，并研究它們的酶學(xué)性質(zhì)，將有助于理解這3種酶以及它們的協(xié)同作用。

[1] Gupta P,Samant K,Sahu A.Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their cellulolytic potential[J].Int J Microbiol,2012,2012:1-5.

[2] Scharf M E,Tartar A.Termite digestomes as sources for novel lignocellulases[J].Biofuels Bioprod Bioref,2008,2(6):540-552.

[3] Ragauskas A J,Williams C K,Davison B H,et al.The path forward for biofuels and biomaterials[J].Science,2006,311:484-489.

[4] 陳虹，梅建鳳，閔航.白蟻腸道微生物[J].微生物學(xué)雜志,2005,25(2):75-79.

[5] K?nig H.Bacillusspecies in the intestine of termites and other soil invertebrates[J].J Appl Microbiol,2006,101(3):620-627.

[6] 吳燕,侯信鋒,遲紹麗,等.白蟻棲息環(huán)境中蠟狀芽孢桿菌的分離及其纖維素酶活性分析[J].微生物學(xué)通報,2012,39(5):638-644.

[7] Dr?ge S,Fr?hlich J,Radek R,et al.Spirochaetacoccoidessp.nov.,a novel coccoid spirochete from the hindgut of the termiteNeotermescastaneus[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(1):392-397.

[8] Tamburini E,Perito B,Mastromei G.Growth phase-dependent expression of an endoglucanase encoding gene (eglS) inStreptomycesrocheiA2[J].FEMS Microbiol Lett,2004,237(2):267-272.

[9] 何剛強(qiáng)，堵國成，劉立明.從白蟻中分離篩選纖維素分解菌及其產(chǎn)酶性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009,28(3):352-355.

[10] 吳燕,遲紹麗,倪金鳳．從白蟻中分離到具有纖維素酶活的貪噬菌[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2011，48(19)：95-98．

[11] Somogyi M.Note on sugar determination[J].J Biol Chem,1952,195:19-23.

[12] Chou J,Chen H W M,Arun A B,et al.Trabulsiellaodontotermitissp.nov.,isolated from the gut of the termiteOdontotermesformosanusShiraki[J].Int J Syst Evol Microbiol,2007,57(4):696-700.

[13] Ma L,Zhang J,Zou G,et al.Improvement of cellulase activity inTrichodermareeseiby heterologous expression of a beta-glucosidase gene fromPenicilliumdecumbens[J].Enzyme Microb Tech,2011,49(4):366-371.

[14] Lee Y J,Kim K,Lee H,et al.Purification and characterization of cellulase produced byBacillusamyoliquefaciensDL-3 utilizing rice hull[J].Bioresour Technol,2008,99(2):378-386.

[15] Zhao K,Guo L Z,Lu W D.Extracellular production of novel halotolerant,thermostable,and alkali-stable carboxymethyl cellulase by marine bacteriumMarinimicrobiumsp.LS-A18[J].Appl Biochem Biotech,2012,168(3):550-567.

[16] Jabbar A,Rashid M H,Javed M R,et al.Kinetics and thermodynamics of a novel endoglucanase (CMCase) fromGymnoascellacitrinaproduced under solid-state condition[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35(6):515-524.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Isolation of cellulose-degrading strains from the gut of termites andcharacterization of its cellulase-producing capability

ZHANG Jianfen,YU Cuijun,TAO Weifeng

(College of Biology and Environmental Engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

Five mesophilic bacteria with cellulose-degrading ability were isolated from the gut of termites (OdontotermesformosanusShiraki). Strain CMC-4 with high cellulose-degrading ability was identified asTrabulsiellaodontotermitisZJSRU-4 according to physiological tests and phylogenetic analysis.High carboxymethyl cellulase(CMCase) andβ-glucosidase activity was detected,and filter paper activity was also produced at a low level.When sodium carboxymethyl cellulose was used as carbon source,CMCase activity reached 20.8 U/mL at 36 h andβ-glucosidase activity 18.2 U/mL at 44 h. Maximum CMCase activity was at pH 6.5,40 ℃,while maximumβ-glucosidase activity was at pH 6.0,40 ℃.This strain has potential industrial application to produce cellulose.Keywords：termite;cellulose-degrading bacteria;isolation;carboxymethyl cellulase;Trabulsiellaodontotermitis

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.006

2013-11-07

國家自然科學(xué)基金青年基金(21102131)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2012R420023)；浙江樹人大學(xué)學(xué)生課題(SH2013S03)

張建芬(1979—)，女，博士，副教授，研究方向：生物催化與微生物轉(zhuǎn)化，E-mail：grace_zjf@126.com

Q814

A

1672-3678(2014)06-0027-06