胡學超，張 麗，任路靜，紀曉俊，黃 和

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211800)

菌種保藏方法對裂殖壺菌生長及發(fā)酵性能的影響

胡學超，張 麗，任路靜，紀曉俊，黃 和

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211800)

考察保護劑、保藏溫度及預(yù)冷凍方法對Schizochytriumsp.HX-308菌種存活率及發(fā)酵性能保持的影響。結(jié)果顯示：在-80 ℃低溫保藏6個月后，滲透性保護劑的細胞存活率均比非滲透性保護劑高了5%，其中用60%(質(zhì)量分數(shù))海藻糖的保護劑最終的株細胞存活率達到80.02%，明顯優(yōu)于其他保護劑。采用液氮-196 ℃保藏菌種(兩步預(yù)冷凍法、60%海藻糖保護劑)，存儲6個月后存活率高達90.70%，生物量、油產(chǎn)量和二十二碳六烯酸(DHA)產(chǎn)量分別達到了61.65、26.41和11.10 g/L，為最優(yōu)的保藏方法，為裂殖壺菌的實驗室研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種長期安全的保藏法。

裂殖壺菌；DHA；菌種保藏；保護劑

二十二碳六烯酸(C22:6,DHA)是一種重要的ω-3型長鏈多不飽和脂肪酸，在促進腦細胞生長發(fā)育、提高視力以及預(yù)防心腦血管疾病等方面具有顯著功效[1-2]，被科學家譽為“腦黃金”。迄今為止，DHA生產(chǎn)菌主要為破囊壺菌、裂殖壺菌等海生真菌和海生異養(yǎng)微藻。其中，裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)屬于真菌門(Eumycoat)、卵菌綱(Oomycetes)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae),其具有生長速度快、易于培養(yǎng)、細胞內(nèi)脂肪酸和DHA含量高等優(yōu)勢，已被證實為理想的DHA生產(chǎn)菌株[3]。

菌種保藏是微生物研究中的一項基礎(chǔ)工作，對于微生物發(fā)酵的科研和生產(chǎn)，菌種具有優(yōu)良的發(fā)酵性能是至關(guān)重要的。目前，微生物培養(yǎng)過程中避免不了頻繁的連續(xù)傳代，有些特殊的菌種更需要間斷性的活化培養(yǎng)來維持其細胞生物活性。但這種頻繁的接種，不僅會增加菌種被污染的可能性，而且大大提高菌種基因突變[4]。因此，選擇一種較持久并能最大限度保持細胞特性，并降低甚至阻斷這種遺傳漂變的保藏方法顯得尤為重要。現(xiàn)在微生物保藏的方法主要有傳代法、干燥法、冷凍法及冷凍干燥法，其中后兩者是應(yīng)用最廣也是最長期安全的方法。Samuele等[5]探究了白腐真菌低溫甘油管保藏、低壓冷凍保藏和液氮保藏法3種保藏法對菌種性能的影響，結(jié)果證明前兩者的保藏方法更適合白腐真菌的保藏。馬學斌等[6]探討了不同保藏方法對海洋細菌的長期保存效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%脫脂乳和 35%甘油肉湯對海洋細菌的長期保存效果較好。

本文將主要從保藏溫度、保護劑類型和預(yù)冷凍方法3個方面，詳細探討不同的冷凍保藏方法對Schizochytriumsp.HX-308存活率和發(fā)酵參數(shù)的影響，并從理論上解釋這些因素對細胞保藏過程中的作用，為尋求一種最佳的保藏方法以減緩Schizochytriumsp.HX-308菌種的退化速度提供指導。

1 材料與方法

1.1 菌種

裂殖壺菌Schizochytriumsp.HX-308，筆者所在實驗室自主篩選獲得，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號CCTCC M 209059)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 15、MgSO4·7H2O 5、KCl 2、CaCl21、NaHCO30.5、KH2PO44、酵母膏 2、谷氨酸鈉10、葡萄糖 40。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：Na2SO415、MgSO4·7H2O 5、KCl 2、(NH4)2SO42、KH2PO44、酵母膏 2、谷氨酸鈉10、葡萄糖 100。

以上培養(yǎng)基都在121 ℃、30 min條件下滅菌，并以體積分數(shù)為0.2%的量向培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為50、50和0.25 mg/mL的維生素B1、B6和B12母液，終質(zhì)量濃度分別為 0.1、0.1 mg/mL和0.5 μg/mL。

1.3 培養(yǎng)方法

種子和發(fā)酵培養(yǎng)方法參照文獻[7]。

1)不同保護劑的考察 將活化好的菌株與配制好的不同保護劑按體積比1∶ 1的比例加入到菌株保藏管中，混勻后置于-80 ℃超低溫冰箱中保藏。

2)不同保藏溫度的考察 將活化好的菌株與40%甘油保護劑按1∶ 1的比例加入到菌株保藏管中，混勻后置于-80 ℃超低溫冰箱和-196 ℃液氮中保藏。

3)-196 ℃液氮保藏法的優(yōu)化 將活化好的菌株與保護劑按1∶ 1的比例加入到菌株保藏管中混勻。一組直接置于-196 ℃液氮中保藏；另一組先于4 ℃冰箱中存放30 min,再將保藏管放入-80 ℃冰箱中存放12 h，最后將凍存管投入-196 ℃液氮中保藏。

1.4 分析方法

發(fā)酵液中葡萄糖和谷氨酸鈉濃度采用SBA-40C型生物傳感儀(山東省科學院生物研究所)進行分析檢測。細胞干質(zhì)量的測定和油脂提取方法參照文獻[8]；脂肪酸甲酯制備及氣相色譜分析方法參照文獻[9]。

細胞存活率測定參照文獻[5]，采用臺盼藍染色法進行。具體方法為吸取50 μL細胞懸液到EP管內(nèi)，加入臺盼藍染色液50 μL，輕輕吹打混勻，3～5 min(染色時間不宜過長)后用血細胞計數(shù)板計數(shù)。

細胞存活率=(細胞總數(shù)-藍色細胞數(shù))/細胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 -80 ℃超低溫保藏下保護劑對Schizochytrium sp.HX-308菌種存活率的影響

在菌種保藏過程中，冷凍保護劑起到保護細胞免受冷凍損傷的重要作用。它可以改變細胞周圍的物理、化學環(huán)境，減少不必要的力學損傷，從而最大限度地保持細胞的生理和生物活性[10]。冷凍保護劑按其對細胞作用的部位，可以分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。滲透性保護劑一般都是一些小分子物質(zhì)，如甘油、二甲基亞砜(DMSO)、單糖、二糖和氨基酸等，它們可以滲透到細胞內(nèi)部；非滲透性保護劑一般是一些大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多聚糖和聚乙二醇等，它們不能滲透到細胞內(nèi)部，只能作用于細胞表面[11]。

根據(jù)Schizochytriumsp.HX-308菌種的細胞特性，筆者選取了這兩類保護劑中幾種代表性的保護劑，探討這些保護劑及其不同濃度對菌種的影響，結(jié)果見表1。由表1可以看出：保藏1個月后，滲透性保護劑和非滲透性保護劑的菌種平均存活率分別為92.48%和89.69%；保藏6個月后，滲透性保護劑的菌種平均存活率在75%，而非滲透性保護劑的菌種平均存活率僅為70%，而且前者的存活率下降速率比后者高了2.02%。由此可以發(fā)現(xiàn)，在-80 ℃超低溫保藏下，滲透性保護劑的保持效果較優(yōu)于非滲透性保護劑。這主要是因為，滲透性保護劑含有較多的羥基，不僅能與細胞表面的自由基結(jié)合，形成保護層，還能滲透到細胞內(nèi)部結(jié)合自由水，減少了冰晶形成，從而對細胞內(nèi)部起到保護作用，降低了力學損傷對細胞造成的破壞[12]。

在2種滲透性保護劑中，40%(體積分數(shù))甘油和60%(質(zhì)量分數(shù))海藻糖的保藏效果為較佳。6個月后菌種存活率最高，分別為75.26%和80.02%；存活率下降比率也最慢，分別僅為4.12%和3.33%。在2種非滲透性保護劑中，30%(體積分數(shù))聚乙二醇20 000的保藏效果較佳，6個月后菌種存活率和存活率下降比率分別為72.23%和4.63%。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60%海藻糖的保藏效果最佳。這主要是因為，海藻糖屬于半滲透性保護劑，只能滲透到細胞壁，胞內(nèi)的水形成部分冰晶，使保護劑的局部濃度增大，從而提高了保護劑玻璃化的溫度，這樣保藏環(huán)境就較容易達到玻璃化狀態(tài)，而玻璃化狀態(tài)是最穩(wěn)定的狀態(tài)，能很好地保護細胞，保持其生理生化活性[13]。

表1 保護劑對Schizochytrium sp.HX-308存活率的影響

2.2 保藏溫度對Schizochytrium sp.HX-308菌種性能的影響

細胞保藏在某些低溫環(huán)境下，其細胞內(nèi)的生化反應(yīng)可被減緩甚至停止，從而能長期保持其活性，但在復蘇后仍能恢復其正常生理功能。筆者選取了低溫為-20 ℃、-80 ℃和液氮-196 ℃，探討保藏6個月后，菌種存活率及發(fā)酵性能的差異，結(jié)果見表2。由表2可以看出：保藏6個月后，-80 ℃保藏的菌種的存活率最高達到75.26%，同時相應(yīng)的存活率下降比率也最低為4.12%。可是，筆者也發(fā)現(xiàn)一個不尋常的現(xiàn)象，液氮-196 ℃保藏的菌種，在這6個月的保藏中，存活率呈直線下降趨勢，到6個月后，菌種基本全部死亡。

不同保藏溫度對Schizochytriumsp.HX-308菌種發(fā)酵性能的影響如圖1所示。由圖1可知：保藏6個月后，-80 ℃保藏的菌種的發(fā)酵生物量、DHA產(chǎn)量稍高于-20 ℃，分別達到了50.91和10.70 g/L。同樣也發(fā)現(xiàn)，液氮-196 ℃保藏的菌種在6個月后，菌種的基本發(fā)酵性能也基本退化，無法進行發(fā)酵生產(chǎn)。

王華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，液氮-196 ℃保藏是目前微生物保藏中公認的最安全、最有效的長期保藏方法。但在本試驗中，液氮-196 ℃保藏菌種基本都死亡了，有悖于常理。這可能是因為，在液氮-196 ℃保藏的處理方法是將菌種和保護劑直接投入液氮中保藏，這將使細胞瞬間處于一個極低的環(huán)境，并且這種冷凍速率隨機性大、不穩(wěn)定，這就一方面導致胞外的水分大量結(jié)冰，胞內(nèi)水分外滲，細胞皺縮變形；另一方面，導致細胞內(nèi)的自由水瞬間形成大量的冰晶，這些冰晶極大地破壞了細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)合這兩方面的原因，導致了對細胞形成了致命性的力學損傷[15-17]。

表2 保藏溫度對Schizochytrium sp.HX-308菌種存活率的影響

圖1 保藏溫度對Schizochytrium sp.HX-308菌種發(fā)酵性能的影響Fig.1 Effects of preservation temperature on fermentation performance of Schizochytrium sp.HX-308

2.3 液氮-196 ℃保藏法的優(yōu)化研究

基于2.2中液氮-196 ℃保藏法菌種全部死亡的現(xiàn)象，因此有必要對液氮保藏進行優(yōu)化。一方面，采用分步預(yù)冷凍法：先將裝有按一定比例混合的菌種和保護劑的保藏管置于4 ℃預(yù)冷凍30 min，再將保藏管置于-80 ℃預(yù)冷凍12 h，最后將保藏管投入液氮-196 ℃中長期保藏。另一方面，優(yōu)化保護劑：根據(jù)2.1中的結(jié)果，分別選取保藏效果較佳的一個滲透性保護劑海藻糖和非滲透性保護劑PEG20000以及兩者混合的混合保護劑。

6個月后，菌種存活率及發(fā)酵性能結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：采用兩步預(yù)冷凍法后，菌種的存活率明顯提高，6個月后存活率基本上都在75%以上，其中60%海藻糖保藏的菌種存活率最高，達到了90.70%，平均比其余3種保護劑高了13.06%，其平均存活率下降比率也最低，僅為1.67%；同時60%海藻糖的菌種的最終發(fā)酵指標生物量、油產(chǎn)量和DHA含量較其他保護劑也稍高，分別為61.65、26.41和11.10 g/L。因此，在液氮-196 ℃中，采用60%海藻糖作為保護劑的兩步預(yù)冷凍法，保藏效果較好，為裂殖壺菌的實驗室研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種長期安全的保藏法。

圖2 保護劑對Schizochytrium sp.HX-308菌種存活率及發(fā)酵性能的影響Fig.2 Effects of protectants on survival rate and fermentation performance of Schizochytrium sp.HX-308

3 結(jié) 論

考察了不同保護劑、不同保藏溫度及不同預(yù)冷凍方法對Schizochytriumsp.HX-308菌種存活率及發(fā)酵性能保持的影響。在-80 ℃低溫保藏下，不同保護劑對Schizochytriumsp.HX-308菌種保藏效果存在著明顯的差異。滲透性保護劑的細胞存活率比非滲透性保護劑高5%，其中60%海藻糖最終的菌種存活率達到了80.02%，明顯優(yōu)于其他保護劑。采用60%海藻糖為保護劑，結(jié)合兩步預(yù)冷凍法，菌種在液氮-196 ℃環(huán)境下保藏6個月后存活率可達到90.70%，生物量、油產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量無明顯改變，分別達到了61.65、26.41和11.10 g/L。本文提出一種適于裂殖壺菌的-196 ℃液氮保藏法，為長期保藏Schizochytriumsp.菌種并降低其優(yōu)良發(fā)酵性能的退化提供了技術(shù)指導。

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(責任編輯 荀志金)

Effects of different strain preservation methods on cell growth andfermentation performance of Schizochytrium sp.

HU Xuechao,ZHANG Li,REN Lujing,JI Xiaojun,HUANG He

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

The effects of cryoprotectants,preservation temperature and different pre-freezing methods on the survival and the fermentation ofSchizochytriumsp.HX-308 were investigated.Results of different cryoprotectants showed that cell survival rate when using permeable protective agent was 5% higher than that of unpermeable protective agent after preserved 6 months at -80 ℃. Highest cell survival rate of 80.02% was obtained when using 60% trehalose. In addition,further increase of cell survival rate up to 90.70% was obtained when using a two-step pre-freezing method and 60% trehalose as the cryopretectant after 6 months at -196 ℃.Cell dry weight,lipid yield and docosahexaenoic acid(DHA) content reached 61.65 g/L,26.41 g/L and 11.10 g/L,respectively.This preservation method was proved to be the best method and could be used as a long period and safe method for the laboratory research and industrial production ofSchizochytriumsp.

Schizochytriumsp.;docosahexaenoic acid;strain culture;cryoprotectants

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.003

2013-07-19

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021704)；國家科技支撐計劃(2011BAD23B03)；江蘇省自然科學基金(BK2012424)

胡學超(1983—)，男，湖北荊州人，碩士研究生，研究方向：化學工程；任路靜(聯(lián)系人)，講師，E-mail:renlujing@njtech.edu.cn

Q815

A

1672-3678(2014)06-0013-05