蔣厚陽，趙國華,2，楊吉霞,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶 400715）

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性法分析西藏牦牛奶酪中乳酸菌的遺傳多樣性

蔣厚陽1，趙國華1,2，楊吉霞1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶 400715）

目的：利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）法對西藏地區(qū)牦牛奶酪中27 株乳酸菌基因型進(jìn)行同源性分析。方法：利用5 個隨機(jī)引物對Mg2+濃度、dNTP用量、退火溫度、模版用量/引物用量（ng/pmol）4 個條件做單因素梯度試驗，建立最佳反應(yīng)條件，篩選最佳引物，然后對27 株乳酸菌和4 株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，用NTsys 2.10e軟件對擴(kuò)增條帶進(jìn)行聚類和遺傳相似性系數(shù)分析，分析結(jié)果與16S rRNA測序得到的菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果：31 株菌 遺傳相似系數(shù)在0.72～1.00之間，當(dāng)相似性系數(shù)在0.82時，菌株被分成了8 組，菌株按照不同種屬聚類，聚類結(jié)果同16S rRNA測序結(jié)果基本一致，同時成功將Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei兩個亞種區(qū) 分開。結(jié)論：RAPD技術(shù)可以較好地應(yīng)用于西藏地區(qū)牦牛奶酪中乳酸菌親緣性關(guān)系分析。

西藏；牦牛奶酪；乳酸菌；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性；聚類分析

西藏牦牛素有“高原之舟”的美稱，是我國的重要畜種。在高原地區(qū)牦牛乳及其制品是當(dāng)?shù)鼐用竦闹匾称贰Ｄ壳皩τ陉笈Ｈ榧捌涑煞值膱蟮廊諠u增多，但是對于牦牛奶酪中乳酸菌的報道卻很少。

乳酸菌作為奶酪發(fā)酵過程中的關(guān)鍵菌種，對其進(jìn)行分類鑒定有著極其重要的意義。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)最初是由美國科學(xué)家Williams[1]和Welsh[2]等運(yùn)用于基因多態(tài)性分析中。它應(yīng)用短的隨機(jī)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）隨機(jī)擴(kuò)增后產(chǎn)生特異性的DNA圖譜，具有多態(tài)性高、操作簡單，引物沒有嚴(yán)格限制，可以實(shí)現(xiàn)高通量測定等優(yōu)點(diǎn)。擴(kuò)增圖譜重現(xiàn)性不高是RAPD面臨的一個問題，但是通過PCR反應(yīng)程序和體系的優(yōu)化，引物的篩選可以解決圖譜重現(xiàn)性這個問題[3-4]。目前很多國外學(xué)者將RAPD技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌基因型的研究中，如乳酸球菌屬[5]（Lactococcus）、明串珠菌屬[6]（Leuconostoc）、乳桿菌屬[7]（Lactobacillus）、腸球菌屬[8]（Enterococcus），很好地區(qū)別開親緣性較近的菌種。但是國內(nèi)只有很少文獻(xiàn)報道了RAPD在乳酸菌基因分型中的應(yīng)用。如高大威等[9]利用RAPD技術(shù)對鮮牛奶、西紅柿和酸菜中分離出的乳酸菌進(jìn)行聚類分析，確定了乳酸菌間親緣性關(guān)系。秦丹[10]利用RAPD方法對四川臘肉和香腸在加工和貯藏過程中的乳酸菌進(jìn)行分析，并將結(jié)果與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法進(jìn)行比較，兩種方法得到的結(jié)果不完全相同。

本研究通過篩選出隨機(jī)引物M13，單因素試驗獲得較好的圖譜重現(xiàn)性后對27 株分離純化后的乳酸菌和4 株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，用NTsys 2.10e軟件對擴(kuò)增后圖譜進(jìn)行聚類分析，將聚類結(jié)果與各個菌株產(chǎn)地進(jìn)行歸類對比，同時與16S rRNA序列分析后的菌種鑒定結(jié)果結(jié)果進(jìn)行對比，從而探討RAPD技術(shù)在天然乳酸菌菌種分類鑒定方面的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

供試菌株分離自西藏牦牛奶酪，由西藏農(nóng)牧學(xué)院提供（表1）。標(biāo)準(zhǔn)菌株：Lactobacillus casei ATCC 393，Lactobacillus paracasei ATCC BAA-52，Lactobacillus plantarum ATCC 8014，Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

表1 供試菌株Table1 Strains isolated from yak milk cheeses

續(xù)表1

MRS培養(yǎng)基的配制參照參考文獻(xiàn)[11]。

Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker 北京鼎國生物科技有限公司；Taq酶（5 U/μL）、dNTPs（10 mmol/L）、10×酶緩沖液、MgCl2（25 mmol/L） 寶生物工程（大連）有限公司；1 kb DNA Ladder、溶菌酶、乙二胺四乙酸鈉、Tris-base、異硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯 加拿大BBI公司；瓊脂糖 西班牙Agarose公司；蛋白酶K 美國Sigma公司；Gelred核酸染料 美國Biotium公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；實(shí)驗引物100 bp DNA Ladder 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HB031金屬恒溫加熱器 上海博彩生物技術(shù)有限公司；SIM-F140AY65型制冰機(jī) 三洋國際貿(mào)易有限公司；1-15PK小型臺式離心機(jī) 德國Sigma實(shí)驗室離心機(jī)公司；Biospec-mini型島津DNA/RNA/蛋白質(zhì)分析裝置日本島津制作所；S1000高性能PCR儀、164-5050伯樂基礎(chǔ)電源電泳儀、Syngene GeneGenius 凝膠成像系統(tǒng)美國Syngene有限公司；GL-88B渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌DNA基因組提取

用試劑盒提取乳酸菌基因組DNA，提取DNA保存于－20 ℃冰箱中。測定提取DNA的OD260nm、OD280nm及OD260nm/OD280nm值，DNA質(zhì)量濃度ρ/（μg/mL）按下式計算[12]。

ρ= OD260nm×50×n

式中：50為比例系數(shù)；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.2 乳酸菌16S rRNA PCR

采用細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物[13]：正向引物為27f（5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’），反向引物為1 492r（5’- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）對27 株菌提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳。將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。

1.3.3 16S rRNA序列同源性分析

登陸NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫，用BLAST軟件將16S rRNA測序結(jié)果與已知序列進(jìn)行相似性分析[11]，同時對27 個菌株的測序結(jié)果采用Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean（UPGMA）法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建各菌株的遺傳距離聚類圖。

1.3.4 RAPD隨機(jī)引物的篩選及PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

隨機(jī)引物的篩選：通過對5 條不同隨機(jī)擴(kuò)增引物（表2）進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)條帶的多態(tài)性和亮度選擇出最適引物，進(jìn)行后續(xù)單因素試驗。

表2 隨機(jī)引物編號及序列Table2 Primers of RAPD and their sequences

PCR反應(yīng)體系優(yōu)化：預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)體系[15]為5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，模版DNA/引物用量=20，10×Taq酶緩沖液（無Mg2+）2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.6 μL。

Mg2+濃度優(yōu)化：預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度分別設(shè)為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L，其余試劑濃度保持不變，選擇最佳Mg2+濃度。

模版DNA/引物用量比優(yōu)化：預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)體系中模版DNA/引物用量的比例分別設(shè)為5、10、20、40、80，其余試劑濃度保持不變，選擇最佳模版DNA/引物用量比例。

dNTP用量優(yōu)化：預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)體系中dNTP用量分別設(shè)為30、60、90、120、150 μmol/L；其余試劑濃度保持不變，選擇最佳dNTP用量。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)程序[15]為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35 個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min。

退火溫度的優(yōu)化：預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)條件中退火溫度分別設(shè)為46、47、48、49、50℃，其余條件保持不變，選擇最佳退火溫度。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳（70 V，1 h），Gelred染色后凝膠成像。通過電泳條帶的數(shù)量、亮度、重復(fù)性和特異性條帶來確定最佳反應(yīng)條件。

1.3.5 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer混勻，點(diǎn)樣于凝膠孔，用1 kb DNA Ladder作為分子質(zhì)量標(biāo)尺，電泳緩沖液為1×TAE，70 V恒壓電泳60 min，Gelred染色后通過凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.6 RAPD 譜帶分析

各菌株的擴(kuò)增圖譜上特定位點(diǎn)無條帶的賦值為0，有條帶的賦值為1，用NTsys 2.10e制作為“0，1”文件，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建各菌株的遺傳距離聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增電泳圖及16S rRNA序列同源性分析結(jié)果

圖1 DNA電泳圖（a）和16S rRNA片段擴(kuò)增圖（b）Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA (a) and 16S rRNA amplification products (b)

圖1a顯示了27 株菌的DNA提取結(jié)果，OD260nm/ OD280nm的范圍在1.8～2.2之間，在23 000 bp處有明顯的單一條帶。圖1b顯示了27 株菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果，在1 500 bp處有明顯的單一條帶。說明各菌株基因組DNA均被成功提取出，同時成功擴(kuò)增出目標(biāo)片段。

圖2 27株菌的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 27 strains based on 16S rRNA

由圖2可知，27 株菌分為6 個大的分支，其中21-1、16-4、17-1、26-1、15-1、21-2、123-4、12-2、122-1、20-1、13-3、23-3、11-2、24-3、12-1、02-1、14-3、19-2位于一個分支，屬于Lactobacillus casei或者Lactobacillus paracasei。125-2處于一個分支，屬于Lactobacillus parabuchneri。16-1、16-2、19-1位于一個分支，屬于Lactobacillus diolivorans。17-5、28-1、20-2位于一個分支，屬于Lactobacillus plantarum。14-1位于一個分支，屬于Lactobacillus helveticus。123-2位于一個分支，屬于Leuconostoc mesenteroides。圖中未能將Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei分開。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 退火溫度

圖3 不同退火溫度下菌株23-3的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.3 Influence of PCR annealing temperature on RAPD profiles of strains 23-3

由圖3可知，退火溫度由46 ℃升到48 ℃過程中，條帶的亮度逐漸增加，溫度由48 ℃升到50 ℃的過程中，條帶的亮度和數(shù)量保持不變，同時條帶整體重現(xiàn)性較好，考慮到退火溫度較低時引物與模版結(jié)合更好，所以PCR反應(yīng)中退火溫度選用48 ℃。

2.2.2 模版DNA/引物用量比

圖4 不同模版DNA/引物用量對菌株23-3 RAPD擴(kuò)增圖譜的影響Fig.4 Influence of DNA template/primer ratio on RAPD profiles of strains 23-3

由圖4可知，電泳條帶的整體重現(xiàn)性很好，在模板DNA/引物用量比為5和10的情況下出現(xiàn)5 個條帶，同時考慮到在用量比為10情況下條帶亮度更佳，所以25 μL PCR反應(yīng)體系模版DNA/引物用量比選用10。

2.2.3 Mg2+濃度

圖5 不同Mg2+濃度對菌株23-3 RAPD擴(kuò)增圖譜的影響Fig.5 Influence of Mg2+concentration on RAPD profiles of strains 23-3

由圖5可知，電泳條帶整體重現(xiàn)性很好，隨著Mg2+濃度的升高，條帶的亮度逐漸增加，在Mg2+濃度為3.0 mmol/L時效果最佳，所以25 μL PCR反應(yīng)體系中Mg2+的濃度選用3.0 mmol/L。

2.2.4 dNTP用量

圖6 不同dNTP用量對菌株23-3 RAPD擴(kuò)增圖譜的影響Fig.6 Influence of dNTP amount on RAPD profiles of strains 23-3

由圖6可知，隨著dNTP用量的增加條帶的亮度顯著增加，在150 μmol/L時達(dá)到最亮，同時條帶整體重現(xiàn)性較好，在150 μmol/L條件下達(dá)到了7 條，所以25 μL PCR反應(yīng)體系中dNTP用量選用150 μmol/L。經(jīng)過單因素試驗，得到優(yōu)化的RAPD擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min；48 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35 個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min。優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系為：25 μL總反應(yīng)體積，模版DNA/引物用量=10，10×Taq酶緩沖液（無Mg2+）2.5 μL，25 mmol/L MgCl23.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，滅菌純水補(bǔ)至25 μL。對4 株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和27 株分離乳酸菌進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。

2.3 整體乳酸菌RAPD圖譜

由圖7可知，27 株西藏牦牛奶酪分離乳酸菌和4 株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株用M13引物擴(kuò)增并電泳后，所有菌株均擴(kuò)增出明顯的條帶，同時16S rRNA鑒定出相同屬的菌株之間可以看出明顯的相似性，各個菌株之間也存在特異性，擴(kuò)增出的條帶數(shù)目在3～10 條之間，所獲得的片段分子質(zhì)量大小在250～3 000 bp之間。

圖7 牦牛奶酪中31株乳酸菌的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.7 RAPD profiles of 31 strains isolated from yak milk cheeses

2.4 聚類分析結(jié)果

圖8 31 株乳酸菌親緣關(guān)系聚類樹狀圖Fig.8 Cluster dendrogram generated from similarity coefficient matrix of 31 lactic acid bacteria

用NTsys2.10e軟件，按照UPMGA法，對供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類分析，得到聚類分析圖。由圖8可知，當(dāng)相似性系數(shù)為0.82時，分離自牦牛奶酪的27 株乳酸菌和4 株乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株被分成了8 個組。第一組包括11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、12-1、19-2、14-3、17-1和casei標(biāo)準(zhǔn)菌株，它們都是Lactobacillus casei。第二組只有一支菌123-2，為Leuconostoc mesenteroides。第三組中16-1、16-2、19-1聚為第一分支，它們是Lactobacillus diolivorans。另一分支為125-2，是Lactobacillus parabuchneri，Lactobacillus rhamnosus單獨(dú)成為一個分支。第四組只有一支菌14-1，為Lactobacillus helveticus。第五組中paracasei標(biāo)準(zhǔn)菌株單獨(dú)成為一分支，26-1和123-4聚為另一分支，為Lactobacillus paracasei。第六組只有一支菌16-4，為Lactobacillus casei。第七組只有一支菌20-1，為Lactobacillus casei。第八組包括17-5、28-1、20-2和plantarum標(biāo)準(zhǔn)菌株，它們都是Lactobacillus plantarum。通過聚類分析圖和16S rRNA測序結(jié)果之間的相互比較可以發(fā)現(xiàn)RAPD聚類分析結(jié)果同16S rRNA測序結(jié)果基本一致，但是16S rRNA 進(jìn)化樹圖并不能夠?qū)actobacillus paracasei和Lactobacillus casei兩個亞種區(qū)分開，而利用RAPD聚類分析結(jié)果可以將其區(qū)分開。由此可以得出在乳酸菌基因型分類鑒定中，RAPD對于親緣型很近菌株的鑒定效果要優(yōu)于16S rRNA同源性分析，更適合于西藏牦牛奶酪中乳酸菌親緣性關(guān)系分析。

3 討 論

西藏地區(qū)居民主要采用傳統(tǒng)手工方法制作奶酪，由于產(chǎn)地、乳酸菌種、制作工藝的不同，導(dǎo)致奶酪風(fēng)味和質(zhì)地的多樣化。乳酸菌又是奶酪制作過程中的核心，是奶酪品質(zhì)好壞的關(guān)鍵。建立系統(tǒng)的鑒定方法對奶酪中乳酸菌進(jìn)行分析，會對當(dāng)?shù)啬汤抑破焚|(zhì)量的提高起到很大的借鑒作用。

目前對于細(xì)菌的鑒定主要有表型鑒定和基因型鑒定兩種方法。表型鑒定不僅在操作上具有一定的復(fù)雜性，同時在鑒定的水平上只能達(dá)到屬的水平，難以達(dá)到種水平的鑒定[16]。而RAPD技術(shù)運(yùn)用隨機(jī)引物對不同種群的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，不僅可以在分子水平上對菌株之間進(jìn)行分類和鑒定，還可以整體基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測，同時操作簡易，準(zhǔn)確性高。許多國外學(xué)者已經(jīng)成功地將RAPD技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌的分離鑒定。如Gevers等[17]運(yùn)用隨機(jī)引物（GTG）5成功地完成對干香腸中乳桿菌亞種的分類和鑒定。Corroler等[18]運(yùn)用RAPD技術(shù)對不同季節(jié)采集的牛奶中L. lactis subsp. lacti和L. lactis subsp. cremoris兩個亞種進(jìn)行分類和鑒定。Cocconcelli等[19]運(yùn)用RAPD技術(shù)區(qū)分開嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、瑞士乳桿菌（L. helveticus）、干酪乳桿菌（L. casei）、植物乳桿菌（L. plantarum）、糞腸球菌（Ent. faecalis）、屎腸球菌（Ent. faecium）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等菌株。Nigatu等[20]利用RAPD技術(shù)對45株乳桿菌進(jìn)行區(qū)分，所有菌株均擴(kuò)增出了不同的多態(tài)性條帶，并且相似度在72%以上，對乳桿菌屬進(jìn)行了最集中和廣泛的研究。

根據(jù)決策對象、決策指標(biāo)、聚類結(jié)果建立決策表，令決策表DT=(U,P∪D)，子集D=aqeuumu為決策屬性集，子集P={aj|j=1,2,…,m}為條件屬性集，U={i|i=1,2,…，n}為論域，aij表示決策對象i在條件屬性aj上的值。

本研究利用16S rRNA和RAPD技術(shù)對西藏牦牛奶酪中乳酸菌的基因型和遺傳多樣性進(jìn)行了分析，用NTsys 2.10e軟件計算出了31 株乳酸菌菌株之間的遺傳相似系數(shù)矩陣，并用UPMGA法作聚類分析圖，與16S rRNA序列分析結(jié)果相對比。在與16S rRNA序列分析結(jié)果的比較中，兩種基因型方法得出的結(jié)果基本是一致的。同時在RAPD的聚類圖中將L. casei和L. paracasei這兩個亞種有效地區(qū)分開來，這是16S rRNA技術(shù)在進(jìn)行同源性分析時做不到的，同時相關(guān)文獻(xiàn)中也無類似報道。綜合比較結(jié)果考慮，RAPD技術(shù)在乳酸菌分類鑒定中有一定的應(yīng)用價值，同時它有操作簡單快速、種間和種內(nèi)區(qū)分效率高、費(fèi)用低的優(yōu)勢，與其他表型和基因型方法相結(jié)合，可提高菌種鑒定效率和準(zhǔn)確性。

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Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis of Lactic Acid Bacteria from Yak Milk from Tibet Area

JIANG Hou-yang1, ZHAO Guo-hua1,2, YANG Ji-xia1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Key Laborat ory of Agricultural Product Processing, Chongqing 400715, China)

Objective: This study analyzed the homology of 27 strains of lactic acid bacterial genotype from Tibetan yak cheese by randomly amplif ed polymorphic DNA (RAPD) method. Methods: To establish a reliable RAPD protocol with 5 primers, the optimal primers and PCR conditions for the quality and reproducibility of RAPD prof les were investigated, including Mg2+concentration, dNTP amount, annealing temperature, and DNA template/primer ratio. The optimal PCR procedure and reaction reagent concentration were employed for RAPD amplif cation of 27 isolates from yak milk cheeses and 4 standard strains of lactic acid bacteria. Electrophoretic profiles were analyzed by NTsys 2.10e software, genetic similarity coeff cients were calculated and a cluster dendrogram was plotted. Results: Genetic similarity coeff cients of 31 strains ranged from 0.72 to 1.00. The cluster dendrogram showed that 31 isolates were classif ed into 8 groups using the similarity coeff cient of 0.82 as a cut-off point. The group discrimination corresponded well with the species assignment by 16S rRNA sequence analysis, and Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei were separated successfully. Conclusion: The RAPD technique was useful for relationship analysis of lactic acid bacteria isolated from Tibetan yak milk cheeses.

Tibet; yak milk cheese; lactic acid bacteria; randomly amplif ed polymorphic DNA (RAPD); cluster analysis

TS252.54

A

1002-6630（2014）23-0215-06

10.7506/spkx1002-6630-201423042

2013-12-19

西南大學(xué)博士啟動基金項目（SWU113035）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目（XDJK2009C039）

蔣厚陽（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：rxxlcool@126.com

*通信作者：楊吉霞（1978—），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yangjx@188.com