王 穎，張 健，王茂劍,*，王共明，李 倩，劉 昕，侯志剛

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006；3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006；4.山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264006）

仿刺參腸道組織酶解工藝優(yōu)化及肽段分析

王 穎1,2，張 健2,3，王茂劍2,3,*，王共明4，李 倩1,2，劉 昕2，侯志剛1,2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006；3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006；4.山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264006）

以仿刺參腸道組織為原料，優(yōu)化酶解工藝條件，研究梯級肽對小鼠原代巨噬細胞過氧化氫損傷的保護作用。采用單因素試驗及響應(yīng)面試驗分析法對酶解工藝條件進行優(yōu)化，利用超濾法獲取不同截留分子質(zhì)量的肽段，采用噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測細胞活力。結(jié)果表明：通過響應(yīng)面優(yōu)化得最佳條件為：酶解溫度50.10 ℃、酶解時間2.84 h、加酶量2.639萬 U時水解度可達41.82%。通過超濾制備，分別得到分子質(zhì)量小于650、650～1 000 u與1 000～10 000 u肽段，各肽段均能顯著提高過氧化氫損傷細胞的細胞活力值，所獲肽段對過氧化氫損傷巨噬細胞具有顯著保護作用，其中小于650 u肽段更佳。

仿刺參腸道組織；酶解；響應(yīng)面；超濾；過氧化氫損傷

海參性味甘、咸、溫，具有很高的滋補和藥用價值，能夠滋陰補腎和益精養(yǎng)血[1]。隨著世界各地越來越關(guān)注對活性多肽的開發(fā)利用，目前海洋活性多肽的研究主要是集中在海綿、芋螺、海葵、海藻等少數(shù)幾種海洋生物中[2]，海參多肽的研究[3]也日益提上議程。但由于多肽研究的整體水平仍然處于初級階段，研究技術(shù)都有待進一步的提高。

有報道研究鹽漬海參腸的加工工藝[4]，但這種粗加工方式損失了大量的活性物質(zhì)。侯英雪等[5]采用酶解工藝，制備成風(fēng)味獨特海參腸口服液。海參腸道組織是海參加工過程的副產(chǎn)物，對這些高蛋白資源的利用僅僅限于粗制飼料甚至成為廢棄物，是對資源的浪費及環(huán)境的污染。對海參腸道組織多肽的有效利用，不僅可以為人體的生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，提高機體的功能調(diào)節(jié)作用，還能提高海參腸綜合加工利用率、滿足市場的需求以及保護環(huán)境復(fù)合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。因此，腸多肽在各個領(lǐng)域如保健、營養(yǎng)、生物、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)均有重要意義[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

新鮮仿刺參腸道組織由煙臺山水海產(chǎn)有限公司提供。

6～8 周齡（KM）昆明小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購于山東大學(xué)動物實驗中心。

木瓜蛋白酶（酶活力100萬 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；牛血清白蛋白 上海藍季科技發(fā)展有限公司；細胞培養(yǎng)基RPMI 1640 美國Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物材料有限公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀儀器有限公司；Pall Minimate切向流超濾系統(tǒng)及650、1 000、10 000 u切向流膜包 美國Pall公司；FP-528Dumas定氮儀 力可儀器香港有限公司；普通抽濾裝置 德國Heidolph公司；TU-1810SPC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；NUAIR-NU-5510E二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Nuaire公司。

1.3 方法

1.3.1 基本營養(yǎng)成分的測定[8]

水分：常壓干燥法；灰分：灼燒稱重法；粗蛋白：杜馬斯燃燒法；粗脂肪：索氏抽提法。

1.3.2 酶解工藝流程

從新鮮的仿刺參中取出腸道組織，去泥清洗干凈，瀝干水分后經(jīng)恒溫水膠體磨研磨勻漿。稱取仿刺參腸道組織勻漿液，按單因素及響應(yīng)面優(yōu)化后條件加入蛋白酶，混合均勻并在浴鍋中進行酶解[6]。酶解完成后，將酶解液于100 ℃水浴中滅酶10 min。

1.3.3 指標(biāo)測定

總蛋白含量的測定：采用杜馬斯燃燒法[9]。

可溶性蛋白的測定：雙縮脲法[11]，配制不同質(zhì)量濃度梯度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，于540 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測各樣品1 mL與4 mL雙縮脲試劑充分搖勻混合后，靜置30 min，在540 nm波長處測吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程得到對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量，從而可求得可溶性蛋白含量。

水解度的測定：雙縮脲-三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法[12-13]，取1 mL酶解液加入1mL TCA中（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%），振蕩混勻，靜置10 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液用雙縮脲法測可溶性蛋白含量。按照下式計算水解度（degree of hydrolysis，DH）。

式中：ρ1為反應(yīng)后酶解液中可溶性蛋白含量/（mg/mL）；ρ2為反應(yīng)前仿刺參腸道組織中可溶性蛋白含量/（mg/mL）；ρ0為仿刺參腸道組織中總蛋白質(zhì)含量/（mg/mL）。

1.3.4 單因素試驗

由于木瓜蛋白酶起活性范圍在中性區(qū)間，調(diào)節(jié)pH值會影響酶解液的風(fēng)味，所以不考慮pH值的影響，對酶解時間、酶解溫度、加酶量為單因素試驗。樣品勻漿液取1 g時，酶解溫度55 ℃、加酶量1萬 U，酶解時間分別為2、3、4、5、6 h；酶解時間3 h，加酶量1萬 U，酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃；酶解溫度55 ℃、酶解時間3 h，加酶量分別為0.5萬、1萬、2萬、3萬、4萬 U。以水解度為衡量指標(biāo)，選出最優(yōu)單因素條件。

1.3.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，以水解度為衡量指標(biāo)，選取時間、溫度和加酶量3 個因素，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，樣品為1 g時，酶解溫度為40、50、60℃，酶解時間為2、3、4 h，加酶量為1萬、2萬、3萬 U，對所木瓜蛋白酶進行酶解條件的優(yōu)化。

1.3.6 超濾工藝制備梯級肽[14-16]

通過優(yōu)化以最優(yōu)條件制備的酶解液進行10 000 r/min離心取上清液，依次通過定性濾紙、0.45 μm和0.22 μm的微孔濾膜過濾。將濾后酶解液加乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為60%，4 ℃靜置過夜，然后將醇沉酶解液進行10 000 r/min離心取上清液，旋蒸后進行冷凍干燥，取1.7 g復(fù)溶至500 mL加入超濾杯中，選擇截留分子質(zhì)量為10 000、1 000、650 u的切向流膜包，流速為2 mL/min，壓力為12 Pa的條件下，進行超濾，當(dāng)超濾杯中酶解液體積剩余1/5時，停止超濾收集濾過液，用蒸餾水將截留液補充至原體積，再次超濾。重復(fù)多次，收集每次的濾過液及截留液，采用雙縮脲法檢測其中蛋白質(zhì)或多肽的含量。

1.3.7 梯級肽對巨噬細胞氧化損傷的保護

1.3.7.1 原代巨噬細胞培養(yǎng)和預(yù)處理[17]

腹腔注射可溶性淀粉于昆明小鼠連續(xù)3 d后，頸椎脫位處死，75%酒精浸泡1 min瀝干消毒處理，腹腔注射4 mL不含胎牛血清1642培養(yǎng)基，并用手指輕揉小鼠腹部5～10 min，小心緩慢吸出腹腔中培養(yǎng)基，收集吹勻離心去上清液，并用不含胎牛血清1640培養(yǎng)基沖洗死細胞3 次，用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基吹勻，在倒置顯微鏡下，將細胞懸液計數(shù)調(diào)整細胞濃度至2×105個/mL，每孔100 μL，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2、4 h，待細胞貼壁，再用不含胎牛血清1640培養(yǎng)基洗去上清及未貼壁細胞，待用。

1.3.7.2 MTT法檢測細胞活力[18]

96 孔板周圍一圈加滿磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），其余每孔100 μL培養(yǎng)基，重復(fù)3 個孔，終止培養(yǎng)前每孔加入20 μL MTT溶液至終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，扣板去除上清，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，使紫色甲臜結(jié)晶徹底溶解。波長492 nm，參比波長630 nm酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度（OD492nm）值。

式中：空白組OD492nm值為無細胞培養(yǎng)基的OD492nm值；對照組為含細胞培養(yǎng)基的OD492nm值；樣品組OD492nm值為含細胞及樣品培養(yǎng)基的OD492nm值。

1.3.7.3 過氧化氫損傷細胞模型的建立

將96 孔板中細胞濃度為2×105個/mL已貼壁細胞更換全部培養(yǎng)基，隨機分為對照組及實驗組，對照組加含胎牛血清1640培養(yǎng)基；實驗組參考文獻[19-21]，加含過氧化氫不同終濃度（100、120、160、180、240 μmol/L）的含胎牛血清1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)4 h，以MTT法檢測細胞存活率，選出細胞損傷達到60%～70%的過氧化氫濃度。

1.3.7.4 梯級肽對細胞的保護作用

將96 孔板中細胞濃度為2×105個/mL已貼壁細胞更換全部培養(yǎng)基，隨機分為對照組、實驗組及損傷組，對照組加入100 μL含胎牛血清1640培養(yǎng)基；實驗組加入100 μL終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400 μg/mL的梯級肽樣品含胎牛血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再以同樣方法加入過氧化氫誘導(dǎo)4 h；損傷組加入100 μL含胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同樣，加入過氧化氫誘導(dǎo)4 h。以MTT法檢測細胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Design-Expert8.0.6和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，組間采用配對樣本t檢驗，雙側(cè)Sig值比較，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本營養(yǎng)成分測定

由表1可知，海參腸道組織粗蛋白含量63.056%，粗脂肪含量8.777%。海參腸道組織蛋白質(zhì)含量豐富，作為多肽的開發(fā)來源，不僅節(jié)約成本提高海參產(chǎn)品的附加值，更有利于環(huán)境保護。

表1 海參腸道組織基本營養(yǎng)成分Table1 Basic nutrient composition of sea cucumber intestinal tissue

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解時間對水解度的影響

圖1 酶解時間對蛋白酶水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著酶解時間的延長，水解度先是上升，達到最大值后開始下降，最后趨于平緩。造成該現(xiàn)象可能的原因是：隨著時間的增加，酶與底物逐漸充分反應(yīng)，水解度逐漸增加，繼續(xù)反應(yīng)達到反應(yīng)后期時，可能出現(xiàn)過度水解現(xiàn)象[22]。酶解產(chǎn)生的多肽進一步水解成小分子氨基酸，由于該檢測方法僅對多肽及蛋白進行檢測，從而使得水解度下降。因此，蛋白酶水解時間選定3 h左右。

2.2.2 酶解溫度對水解度的影響

圖2 酶解溫度對蛋白酶水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，酶解程度的趨勢先是上升，達到最高后繼續(xù)升高加熱溫度水解度開始下降。造成該現(xiàn)象的原因可能是：隨著酶解溫度的上升，酶活性中心逐漸被激活，酶解活力增強[23]，水解度不斷增加。達到最適溫度后，隨著溫度的不斷上升，酶逐漸受熱變性開始失活[24]，水解度下降。因此，蛋白酶最佳酶解溫度在50 ℃左右。

2.2.3 加酶量對水解度的影響

圖3 加酶量對蛋白酶水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

由圖3可知，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增加然后下降并趨于平緩?？赡茉蚴请S著加酶量的增加，底物與酶的接觸增加，加快了反應(yīng)速率。而加酶量繼續(xù)增加會出現(xiàn)過度水解現(xiàn)象，產(chǎn)生該檢測方法不可檢測的氨基酸。綜合考慮，蛋白酶的加酶量選2萬 U左右。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

李冬燕等[25]以海參腸為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過正交試驗及方差分析確定海參腸的最佳酶解工藝條件。正交試驗設(shè)計（orthogonal design）[26-27]和響應(yīng)曲面試驗設(shè)計（response surface methodology，RSM）[28]，都是一種優(yōu)化的數(shù)學(xué)模型，相比較而言響應(yīng)曲面法可以通過所得方程計算出任一條件組合下的函數(shù)值，其優(yōu)勢更加顯著[29]，本實驗即采用該方法。

在單因素試驗所得結(jié)果基礎(chǔ)上，運用Design-Expert軟件中采用Box-Behnken原理設(shè)計試驗，分析3 個因素對水解度的影響。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 酶解工藝條件的響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Design and results for RSM analysis

表3 響應(yīng)面試驗方差分析Table3 Results of ANOVA for the response surface regression model

由表3可知，該模型的F值為52.05，P＜0.000 1，擬合高度顯著。所建立的模型可以很好地反應(yīng)水解度與酶解溫度、酶解時間和加酶量之間的關(guān)系。Prob＞F的值小于0.05表示該因素影響顯著[30]，本實驗中影響度：C＞A＞B，C、A2、B2、C2對結(jié)果影響更為顯著。各因素取最優(yōu)值即酶解溫度50.10 ℃、酶解時間2.84 h、加酶量2.639萬 U時，響應(yīng)所能取得水解度最高為42.45%。驗證該條件下實際水解度為41.82%。由圖4可知，BC與AC曲線變化均陡峭，說明在一定時間和溫度條件下，加酶量對水解度的影響較大，結(jié)合方差分析可以看出AC因素交互作用較大，對水解度有較大影響。

圖4 各因素交互作用對水解度的影響Fig.4 Effect of interaction of various factors on the degree of hydrolysis

2.4 超濾結(jié)果分析

圖5 10 000 （A）、1 000（B）和650 u（C）超濾次數(shù)與多肽含量的關(guān)系Fig.5 Effect of repeated ultrafiltrations on peptide content: MWCO 10 000 (A), 1 000 (B) and 650 u (C) between ultrafiltration times and peptide content

由圖5A可知，復(fù)溶酶解液通過10 000 u膜包時，截留液和濾過液中蛋白質(zhì)及多肽含量隨著超濾次數(shù)的增加逐漸下降[31]，在超濾達到3 次后，其含量基本趨于穩(wěn)定，即分子質(zhì)量大于10 000 u的大分子蛋白質(zhì)及多糖等在截留液中，達到初步分離的目的；取通過10 000 u膜包的濾過液過1 000 u膜包，同樣取通過1 000 u膜包的濾過液過650 u膜包，由圖5B、5C可知，截留液中多肽含量隨超濾次數(shù)增加逐漸降低，在超濾4 次后基本趨于穩(wěn)定，初步分離出分子質(zhì)量小于1 000 u及650 u的濾過液。最后得到分子質(zhì)量分別是小于650、650～1 000、1 000～10 000 u及大于10 000 u這4 個肽段的多肽。

2.5 H2O2細胞損傷模型及梯級肽保護作用

2.5.1 H2O2損傷模型的建立

表4 巨噬細胞的H2O2損傷模型Table4 Hydrogen peroxide-induced damage model of macrophages

由表4可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，細胞的存活率與H2O2濃度呈負相關(guān)，即與對照組相比各實驗組細胞活力隨H2O2濃度增大而下降，無完全存活和完全死亡現(xiàn)象，濃度范圍合適。王世博等[32]在黃芪甲對H2O2作用PC12細胞活力實驗中選取H2O2濃度300 μmol/L損傷度約65%，唐小卿等[33]在姜黃素對H2O2作用PC12細胞的保護實驗中選取100、200 μmol/L細胞損傷率為56.8%和78.6%，本實驗當(dāng)H2O2濃度為160 μmol/L時細胞存活率為31%，即損傷度達到69%，適合做損傷保護實驗。

2.5.2 梯級肽對巨噬細胞的H2O2損傷保護

表5 巨噬細胞H2O2損傷的保護作用Table5 Protective effect of peptides from Apostichopus japonicus intestinal tissue against H2O2-induced macrophage injury

由表5可知，損傷組細胞活力對照組相比差異極顯著（P＜0.01）[34]；Kong Baohua等[35]從乳清蛋白水解產(chǎn)物中提取的抗氧化肽有顯著保護MRC-5細胞抵抗過氧化氫的損傷，本實驗組3 個肽段達到一定質(zhì)量濃度與損傷組對比均有顯著差異（P＜0.05），即對細胞均有保護作用，其損傷保護效果隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而提高；其中當(dāng)小于650 u肽段樣品質(zhì)量濃度為50 μg/mL時已達到650～1 000 u與1 000～10 000 u肽段實驗范圍內(nèi)的最佳損傷保護效果，可知小于650 u肽段損傷保護效果最佳，其余2 種相對較弱。

3 結(jié) 論

本實驗以提高海參加工副產(chǎn)物的利用率為目的，通過使用木瓜蛋白酶對海參腸道組織進行酶解，利用單因素試驗及響應(yīng)面試驗分析確定酶解最佳工藝條件。最佳酶解條件是：酶解溫度50.10 ℃、酶解時間2.84 h、加酶量2.639萬 U，水解度為41.82%。選擇不同截留分子質(zhì)量的超濾膜包，采用梯度稀釋法制備不同分子質(zhì)量大小的肽段，利用MTT法檢測各肽段對原代巨噬細胞的H2O2損傷保護作用，結(jié)果表明其具有明顯的細胞損傷保護能力，其中分子質(zhì)量小于650 u的肽段更佳。

通過優(yōu)化酶解工藝處理海參腸道組織，降低了蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，增加了活性多肽及氨基酸成分，酶解產(chǎn)物活性更強更易于吸收，該工藝操作簡單，加工成本經(jīng)濟。針對本實驗梯級肽制備和抗氧化細胞保護作用活性研究基礎(chǔ)上，可進一步對小肽的純化和的功能鑒定進行深入研究，為海參下腳料的高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

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Optimal Preparation and Characterization of Peptides from Enzymatic Hydrolysis of Apostichopus japonicus Intestinal Tissue

WANG Ying1,2, ZHANG Jian2,3, WANG Mao-jian2,3,*, WANG Gong-ming4, LI Qian1,2, LIU Xin2, HOU Zhi-gang1,2
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China; 2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China; 4. Shan Shui Co. Ltd. Shandong Province, Yantai 264006, China)

This work reports the application of single factor experimental design and response surface methodology to optimize conditions for enzymatic hydrolysis of the intestinal tissue of Apostichopus japonicas and the protective effect of the resulting peptides on primary macrophages of mice from injury caused by hydrogen peroxide. Hydrolysates were fractionated by ultrafiltration membranes with different cut-off molecular weights (MWCO). The cell viability was detected by MTT (3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide) assay. Results showed that the highest degree of hydrolysis of 41.82% was attained after 2.84 h of hydrolysis at 50.10 ℃ with 26 390 U of papain. Peptides with molecular mass less than 650, 650-1 000 and 1 000-10 000 u were separated by ultrafiltration, and they all could significantly increase the viability of primary cells and show a protective effect against hydrogen peroxide-induced injury. Furthermore, the peptide with molecular mass less than 650 u showed better protective capacity.

Apostichopus japonicus intestinal tissue; enzymolysis; response surface analysis; ultrafiltration; hydrogen peroxide-induced injury

Q814.9

A

1002-6630（2014）23-0182-06

10.7506/spkx1002-6630-201423036

2014-06-30

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項（201205027；201105029）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系刺參產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（SDAIT-08）；海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目（20130125）；水生動物營養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位經(jīng)費資助項目（TS 200651036）

王穎（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：yugong_271156317@qq.com

*通信作者：王茂劍（1964—），男，研究員，本科，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：wangmaojian@126.com