潘進權，鐘德廣

（嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

固定化地衣芽孢桿菌產彈性蛋白酶的研究

潘進權，鐘德廣

（嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

為提高彈性蛋白酶的發(fā)酵產能，構建地衣芽孢桿菌連續(xù)發(fā)酵產彈性蛋白酶的生產工藝，本研究采用單因素試驗及響應面分析法對地衣芽孢桿菌凝膠包埋固定化的工藝進行探討，并對固定化細胞的發(fā)酵產酶性能進行分析。結果表明，地衣芽孢桿菌的適宜固定化體系是聚乙烯醇（polyving akohol，PVA）、海藻酸鈉（sodium alginate，SA）和CaCl2，質量分數分別為8.22%、2.27%和2.42%，固定化交聯(lián)劑硼酸的質量分數為4%；固定化地衣芽孢桿菌發(fā)酵產彈性蛋白酶的活力可達到386 U/mL，是相同接種量的游離細胞發(fā)酵酶活力的87%；固定化的地衣芽孢桿菌凝膠球具有很好的穩(wěn)定性，在搖 瓶發(fā)酵的條件下可連續(xù)使用10 批次以上。以上結果表明，復合凝膠包埋制備的固定化地衣芽孢桿菌細胞可用于連續(xù)發(fā)酵產彈性蛋白酶的生產工藝。

地衣芽孢桿菌；固定化；發(fā)酵；彈性蛋白酶

彈性蛋白酶是一種肽鏈內切酶，它以水解不溶性彈性硬蛋白為特征，由于具有治療高血脂癥、防止動脈粥樣硬化等生理作用，長期以來一直被作為生化藥物開發(fā)[1]。此外，由于彈性蛋白酶具有特殊的肽鍵選擇性[2-3]，它對于由小分子氨基酸殘基構成的肽鍵有很強的水解活性，因此它在蛋白質食品加工中有著特殊的用途[4-7]。彈性蛋白酶的生產一直以來多由動物胰臟提取制備，由于受動物臟器資源限制，彈性蛋白酶向來供不應求，市場售價極高。因此，近年來眾多的研究者都轉向微生物源彈性蛋白酶的研究[8-11]，一系列具有產彈性蛋白酶能力的微生物，包括P. aeruginosa、F. immotum、B. subtilis等不斷被發(fā)現[12-14]。然而，從報道的結果來看這些微生物彈性蛋白酶的產率均不高[15]，這在很大程度上限制了微生物源彈性蛋白酶的開發(fā)利用。因此，如何提高微生物彈性蛋白酶的發(fā)酵產能成為了關鍵。

為提高微生物發(fā)酵產彈性蛋白酶的能力，課題組在前期開展了大量的菌種選育工作，并獲得一株具有較強產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DB35-2011。為進一步提高該微生物彈性蛋白酶的發(fā)酵產能，課題組擬從發(fā)酵工藝的角度入手，構建該菌株的彈性蛋白酶連續(xù)發(fā)酵生產工藝。為此，本研究探討了地衣芽孢桿菌固定化的工藝條件，采用二元凝膠（海藻糖凝膠與聚乙烯醇凝膠）包埋法固定化地衣芽孢桿菌，以充分發(fā)揮兩種凝膠各自的優(yōu)點，利用海藻糖凝膠球大孔特性以確保發(fā)酵過程中培養(yǎng)基營養(yǎng)物質及彈性蛋白酶在凝膠球內外較高的傳質效率；聚乙烯醇凝膠則可保證固定化凝膠球有較好的機械強度，以滿足連續(xù)化發(fā)酵的工藝要求。

1 材料與方法

1.1 菌種

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DB35-2011由湛江師范學院酶工程實驗室分離鑒定。

1.2 試劑與儀器

剛果紅-彈性蛋白 美國Sigma公司；聚乙烯醇（polyving akohol，PVA） 上海強順化學試劑有限公司；海藻酸鈉（sodium alginate，SA） 天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心。

723N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；GZX-9140 MBE數顯鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；Rosen PSH-200生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司；HH-601恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司；NYQ-60生物搖床 武漢匯誠生物科技有限公司；PHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠。

1.3 地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)與固定化方法

1.3.1 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.5。

液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40 g/L、蛋白胨20 g/L、麩皮30 g/L（煮汁加入）、磷酸氫二鉀2 g/L、碳酸鈣3 g/L、吐溫-80 2 g/L，pH 7.5。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

將保藏菌種轉接到斜面培養(yǎng)基，在35 ℃條件下培養(yǎng)24 h活化，然后將其接種于液體種子培養(yǎng)基，置于搖床35 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.3 菌懸液的制備

培養(yǎng)獲得的液體種子經10 ℃、8 000 r/min離心20 min，棄除上清液，用無菌生理鹽水按10 mL/g菌體濕質量的比例配成菌懸液。

1.3.4 地衣芽孢桿菌的固定化

稱取一定量的PVA于三角瓶中，按濃度要求加入適量蒸餾水，封口后在80 ℃的恒溫水浴鍋中溶脹約3 h，然后于80 ℃條件下磁力攪拌直至PVA全部溶解；稱取一定量的SA，加入到PVA溶液中，然后在80 ℃條件下繼續(xù)磁力攪拌直至SA完全溶解，即得PVA-SA共混溶液。將融化的PVA-SA共混溶液冷卻到室溫后，按體積比10∶1的比例與菌懸液混合，用注射器吸取混合液滴入預冷的硼酸-CaCl2混合固定液（滅菌后置于4 ℃冰箱預冷），形成固定化細胞凝膠球，于4 ℃冰箱中靜置24 h，取出后用無菌生理鹽水洗滌2～3 次即得到固定化細胞。

1.3.5 游離細胞發(fā)酵實驗

以4%的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在35 ℃、180 r/min條件下進行振蕩培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液測定酶活力。

1.3.6 固定化細胞的發(fā)酵方法

取一定量固定化細胞（相當于液體種子4%的接種量）轉接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度35 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵3 d，取適量的發(fā)酵液測定酶活力。

1.4 分析方法

1.4.1 彈性蛋白酶活性測定

采用改良的Sachar法[16]：彈性蛋白酶作用于與染料偶聯(lián)的彈性蛋白，從而使染料溶于水溶液，通過測定反應上清液的光密度值反映底物蛋白被酶消化的程度以確定酶活力。稱取20 mg剛果紅-彈性蛋白， 溶于1 mL水中，加1 mL pH 7.4、0.2 mol/L硼酸緩沖液，1 mL稀釋的酶液，37 ℃振蕩反應20 min， 加入2 mL pH 6.0、0.7 mol/L磷酸鈉緩沖液終止反應，過濾后測定上清液在590 nm波長處的光密度值。以不加酶液和底物的反應液為空白。在此反應條件下溶解1 mg剛果紅-彈性蛋白底物所需的酶量定義為一個彈性蛋白酶活力單位（U）。

1.4.2 固定化細胞凝膠球的傳質性能測定[17-18]

選擇粒度均勻的凝膠小球50 粒放入裝有惰性紅墨水的三角瓶中，放入搖床，在35 ℃、180 r/min條件下，每隔5～10 min左右剖開凝膠球觀察紅墨水進入凝膠球的部位，記錄凝膠球充滿紅色墨水的時間，根據時間長短分析固定化凝膠球的傳質性能。

1.4.3 固定化細胞凝膠球機械強度的測定

將固定化細胞接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵3 d后，傾出發(fā)酵液，將固定化細胞轉接入新的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，反復多次，直至固定化細胞完全破碎，統(tǒng)計固定化細胞的發(fā)酵批次。根據發(fā)酵批次評價凝膠球機械強度。

1.5 單因素試驗

1.5.1 PVA質量分數對固定化細胞發(fā)酵性能的影響

設定SA及交聯(lián)劑硼酸、CaCl2的質量分數為1.2%、5%、1.2%，分別以不同質量分數5%、7%、9%、11%、13%的PVA制備固定化地衣芽孢桿菌凝膠球，按照1.3.6節(jié)的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定固定化細胞凝膠球機械強度及發(fā)酵液酶活力。

1.5.2 SA質量分數對固定化細胞發(fā)酵性能的影響

設定PVA及交聯(lián)劑硼酸、CaCl2的質量分數為9%、5%、1.2%，分別以不同質量分數0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%的SA制備固定化地衣芽孢桿菌凝膠球，按照1.3.6節(jié)的方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定固定化細胞凝膠球機械強度及發(fā)酵液酶活力。

1.5.3 CaCl2質量分數對固定化細胞發(fā)酵性能的影響

設定PVA、SA及硼酸的質量分數分別為9%、1.2%、5%，考察不同質量分數1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% CaCl2對細胞固定化及發(fā)酵產酶性能的影響。

1.5.4 硼酸質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響

設定PVA、SA及CaCl2的質量分數分別為9%、1.2%、2%，考察不同質量分數l%、2%、3%、4%、5%、6%、7%硼酸對細胞固定化及發(fā)酵產酶性能的影響。

1.6 中心組合試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，利用SAS統(tǒng)計軟件，采用響應面分析法中的中心組合試驗設計，進一步考察因素PVA、SA及CaCl2質量分數對地衣芽孢桿菌固定化及發(fā)酵產酶性能的影響，分析因素間的交互作用并確定各因素的最佳取值，由此確定制備固定化細胞合適的工藝條件。

2 結果與分析

2.1 PVA質量分數對固定化細胞發(fā)酵性能的影響

考察了由不同質量分數PVA制備所得固定化細胞凝膠球的機械強度及發(fā)酵產彈性蛋白酶的性能，實驗結果如表1和圖1所示。

表1 PVA質量分數對固定化細胞凝膠球性能的影響Table1 Effect of PVA mass fraction on gel sphere properties of immobilized cells

圖1 PVA質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.1 Effect of PVA mass fraction on the elastase activity of immobilized cells

由表1可知，當PVA的質量分數在5%以上時，制備所得復合凝膠球具有較好的機械強度，經多次分批發(fā)酵仍可保持完整的形態(tài)；當PVA的質量分數超過11%，復合凝膠球成形較困難，形狀也變得很不規(guī)則，這一結果與文獻[18]報道相吻合。另外，圖1結果顯示，當PVA的質量分數在11%以上時，固定化地衣芽孢桿菌細胞的發(fā)酵產酶能力會有明顯下降，這應該與凝膠球傳質效率的下降有密切關系。因為隨著PVA質量分數的增加，載體凝膠對細胞的封閉性增強，由此將導致營養(yǎng)物質尤其是彈性蛋白酶在凝膠顆粒內外的擴散效率下降，從而影響凝膠顆粒內細胞的生長、發(fā)酵性能及酶的分泌，這一實驗結果與文獻[19]報道基本一致。綜合考慮以上兩方面，制備固定化細胞的PVA質量分數應控制在5%～9%范圍較為適宜。

2.2 SA質量分數對固定化細胞發(fā)酵性能的影響

考察了由不同質量分數SA制備所得固定化細胞凝膠球的機械強度及發(fā)酵產彈性蛋白酶的性能，實驗結果如表2和圖2所示。

表2 SA質量分數對固定化細胞凝膠球性能的影響Table2 Effect of SA mass fraction on gel sphere properties of immobilized cells

圖2 SA質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.2 Effect of SA mass fraction on the elastase activity of immobilized cells

由表2可知，SA質量分數對復合凝膠球的機械強度有顯著的影響。SA質量分數過低時，滴入固定液中的復合載體成形較緩慢，極易形成橢圓形的凝膠球，固定化細胞的封閉性能較差，搖瓶發(fā)酵過程中易造成凝膠球內容物泄露，凝膠球破碎，從而失去連續(xù)發(fā)酵的意義；要保證固定化凝膠球有較好的機械強度，SA的質量分數不能低于1.2%。

圖2結果表明，當SA質量分數在0.8%～2.0%范圍時，固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶的能力基本保持穩(wěn)定，說明在此條件下制備所得凝膠球均有較好的傳質效率；另外，當SA質量分數在0.4%時，發(fā)酵液有相對較高的酶活力，這應該與固定化細胞凝膠球黏連成團，地衣芽孢桿菌細胞從凝膠球內大量釋放有密切關系。綜合考慮凝膠球的機械強度和固定化細胞發(fā)酵產酶性能，SA質量分數控制在1.2%～2.0%較為合適，這一結果與文獻[20]報道結果基本一致。

2.3 CaCl2質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響

考察了CaCl2質量分數對地衣芽孢桿菌固定化及固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶性能的影響，實驗結果如表3和圖3所示。

表3 CaaCCll2質量分數對固定化細胞凝膠球性能的影響Table3 Effect of calcium chloride mass fraction on gel sphere properties of immobilized cells

圖3 CaCl2質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.3 Effect of calcium chloride mass fraction on the elastase activity of immobilized cells

在形成PVA-SA復合凝膠球的過程中，Ca2+作為交聯(lián)劑和海藻酸鈉分子中的—COO－結合，從而使PVA-SA復合液的液滴交聯(lián)固化，形成PVA-SA微球。因此，體系中Ca2+的質量分數對PVA-SA微球的形成也有較大的影響。由圖3可知，當CaCl2質量分數低于1.5%時，固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶的能力將受影響；低于1%時，復合凝膠球的機械強度將受影響。因此，在地衣芽孢桿菌細胞固定化的過程中，CaCl2質量分數應控制在2%以上。

2.4 硼酸質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響

考察了硼酸質量分數對地衣芽孢桿菌固定化及固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶性能的影響，實驗結果如表4和圖4所示。在復合凝膠球的形成過程中，硼酸主要是與PVA發(fā)生作用，促進PVA的相互交聯(lián)，因此其質量分數的高低對復合凝膠球的形成也有一定的影響。由圖4可知：當硼酸質量分數低于1%時，固定化凝膠球幾乎無法成形；硼酸質量分數在2%～3%時，PVA交聯(lián)不夠充分，凝膠球的機械強度較差，固定化細胞發(fā)酵到第二批時已有不同程度的凝膠球破碎及細胞泄露；酶活力測定結果顯示，隨著固定化體系中硼酸質量分數的增加，固定化細胞產酶能力逐漸增大，當硼酸質量分數達到4%以上時，發(fā)酵產酶基本趨于穩(wěn)定。

表4 硼酸質量分數對固定化細胞凝膠球性能的影響Table4 Effect of boric acid mass fraction on gel sphere properties of immobilized cells

圖4 硼酸質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.4 Effect of boric acid mass fraction on the elastase activity of immobilized cells

此外，在實驗過程中還發(fā)現，硼酸在固定液中的溶解度不高，大約在3.5%左右，當硼酸質量分數大于4%時，固定液中會有一定量的硼酸晶體析出，此時固定液中硼酸質量分數達到飽和并保持穩(wěn)定。由此可見，固定液中硼酸的質量分數控制在4%較為合適，其足以維持固定體系中硼酸的飽和狀態(tài)。為此，在后續(xù)實驗中均設定硼酸質量分數為4%。

2.5 固定化細胞凝膠球傳質性能的分析

圖5 PVA（a）與SA質量分數（b）對凝膠球傳質性能的影響Fig.5 Effect of PVA (a) and SA (b) mass fraction on the mass transfer performance of gel spheres

由圖5可知，PVA對復合凝膠球的傳質效率有極顯著的影響，隨著凝膠球中PVA質量分數的增加凝膠球的傳質效率會明顯降低，尤其是當PVA的質量分數大于9%時，物質進出凝膠球所需時間幾乎是直線上升，這也進一步解釋了為什么當PVA質量分數大于9%時，固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶的能力會明顯降低（圖1）；相比而言，SA對凝膠球傳質性能的影響不顯著。

2.6 PVA-SA固定化地衣芽孢桿菌的響應面分析

在保證凝膠球足夠機械強度的前提下，進一步綜合考察了PVA、SA及CaCl2質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響，采用中心組合試驗設計及響應面方法分析了各因素間的交互作用并對各因素取值進行了優(yōu)化。表5給出了因素水平及試驗設計與結果。

表5 中心組合試驗設計方案及結果Table5 Experiment design and results of central composite design

對表5的試驗結果進行回歸分析可以得到以下數學模型：

Y=302.1+44.1A+54.8B+27.4C－55.0A2+25.0AB－22.5AC－24.6B2+14.3BC－22.3C2

分析表明，該回歸模型具有非常高的顯著性（P＜0.01），其R2為0.902 7，說明該模型可以解釋90.27%的實驗結果。圖6～8給出了擬合模型的響應曲面，該曲面的形狀表明在所選取的試驗空間內存在最大響應值。利用SAS軟件分析確定了該最大響應值為（373±40） U/mL，其對應因素A、B、C的取值分別為8.22%、2.27%、2.42%。由此確定了地衣芽孢桿菌二元凝膠包埋體系的組成為：PVA質量分數8.22%、SA質量分數2.27%、CaCl2質量分數2.42%、硼酸質量分數4%。在此條件下制備所得固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶的酶活力平均值為386 U/mL，與模型的預測值基本一致，進一步驗證了該模型的可靠性。此外，以優(yōu)化工藝制備所得固定化細胞凝膠球具有很好的機械強度，在搖瓶發(fā)酵的條件下至少可以發(fā)酵使用10 批次以上。

圖6 PVA與SA質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.6 Response surface plot showing the effects of PVA and SA mass fraction on the elastase yield from immobilized cells

圖7 PVA與CaCl2質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.7 Response surface plot showing the effects of PVA and CaCl2mass fraction on the elastase yield from immobilized cells

圖8 SA與CaCl2質量分數對固定化細胞發(fā)酵產酶的影響Fig.8 Response surface plot showing the effects of SA and CaCl2mass fraction on the elastase yield from immobilized cells

3 結 論

本研究對地衣芽孢桿菌的固定化工藝進行了探討，采用二元凝膠包埋的方法進行地衣芽孢桿菌的固定化，復合凝膠能有效地將PVA凝膠與SA凝膠的優(yōu)點結合起來，既保證了固定化凝膠球有足夠的機械強度，同時又確保了凝膠球有良好的傳質性能，尤其是能夠保障彈性蛋白酶從凝膠球內向發(fā)酵液自由擴散。采用中心組合及響應面分析的方法對固定化的工藝進行了優(yōu)化，確定了合適的工藝條件。在優(yōu)化的條件下制備所得固定化細胞發(fā)酵產彈性蛋白酶的活力可達到386 U/mL，是游離細胞發(fā)酵酶活力（440 U/mL）的87%；優(yōu)化條件下制備得到的固定化細胞有很好的穩(wěn)定性，在分批發(fā)酵條件下可以連續(xù)使用10 批次以上。實驗結果表明，經二元凝膠包埋法制備所得的地衣芽孢桿菌固定化細胞依然保持了較強的發(fā)酵產彈性蛋白酶的活力，制備所得凝膠球具有較好的機械強度，可滿足連續(xù)化發(fā)酵生產工藝的要求。

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Immobilization of Bacillus licheniformis for Enhanced Production of Elastase

PAN Jin-quan, ZHONG De-guang
(School of Life Science and Technology, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China)

To increase the fermentation titer unit of elastase with immobilized Bacillus licheniformis, the immobilization process and fermentation characteristics of Bacillus l icheniformis were investigated and optimized by single-factor experiments and response surface methodology. After optimization, a proper immobilization system was determined, which consisted of polyving akohol (PVA), sodium alginate (SA), calcium chloride and boric acid at a concentration by mass of 8.22%, 2.27%, 2.42% and 4% respectively. Under the optimized conditions, the activity of elastase produced from immobilized Bacillus licheniformis reached 386 U/mL, which was 87% of the fermentation yield with free cells. The immobilized Bacillus licheniformis had good stability, and could be used in fermentation for more than 10 consecutive batches. These experimental results indicate that the immobilized Bacillus licheniformis prepared by composite gel entrapment can be used in continuous fermentation process for the production of elastase.

Bacillus licheniformis; immobilization; fermentation; elastase

Q814.2

A

1002-6630（2014）23-0176-06

10.7506/spkx1002-6630-201423035

2013-12-06

國家星火計劃項目（2013GA780084）

潘進權（1978—），男，副教授，博士，研究方向為酶與發(fā)酵工程。E-mail：pjq78@sina.com