黃 群，楊萬根，金永國，陳宏杰，趙惠云

（1.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

酶法改善卵白蛋白起泡性

黃 群1，楊萬根1，金永國2，陳宏杰2，趙惠云1

（1.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

采用堿性蛋白酶對卵白蛋白進(jìn)行酶法改性處理以改善其起泡性。探討酶解時間、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量因素對卵白蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化酶法改性條件。結(jié)果表明，堿性蛋白酶酶法改性卵白蛋白改善其起泡性的最佳條件為：酶用量144 000 U/g、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.90%、酶解時間34 min。在此條件下酶法改性后卵白蛋白起泡性達(dá)202.0%，為未改性（120%）的1.683 倍。

卵白蛋白；堿性蛋白酶；酶法改性；起泡性

卵白蛋白（ovalbumin），又稱卵清蛋白，為球蛋白水溶液體系——雞蛋清中含量最多的主要蛋白質(zhì)，占蛋清蛋白質(zhì)總量的54%～63%。卵白蛋白為單體、球狀磷酸糖蛋白，分子質(zhì)量為43.0 kD，等電點(diǎn)為4.5，由385 個氨基酸殘基組成，其中50%以上為疏水性氨基酸，是蛋清唯一含有埋藏于疏水核心內(nèi)部的自由巰基的蛋白質(zhì)，自然卵白蛋白貯存期間轉(zhuǎn)變?yōu)闊岱€(wěn)定形式：S-卵白蛋白[1]。卵白蛋白具有良好的功能特性，如起泡性、膠凝性、持水性、成膜性和乳化性等，為食品加工中重要的原輔料，通過改性以改善卵白蛋白功能特性可擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域[2]。蛋白改性通常采用物理改性如熱處理、超高壓、微波、超聲波、紫外輻照等，化學(xué)改性如磷酸化、酰胺化等，酶法和生物工程改性等[3-12]?；瘜W(xué)改性因具有副產(chǎn)物和安全性等問題而難以被實(shí)際應(yīng)用，酶法改性具有條件溫和、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。有研究采用復(fù)合酶法改善大豆分離蛋白起泡性，趙欣等采用堿性蛋白酶改性大豆?jié)饪s蛋白，均有較為理想的效果[13-16]，目前尚未見卵白蛋白起泡性酶法改善的相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶酶法改性以改善提高卵白蛋白起泡性能，在堿性蛋白酶最適作用溫度和pH值條件下，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化酶法改性提高卵白蛋白起泡性的工藝條件，為擴(kuò)展卵白蛋白在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，促進(jìn)我國蛋制品工業(yè)的多元化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋，購于吉首市步步高超市。

堿性蛋白酶（酶活力200萬 U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸銨、氫氧化鈉、濃鹽酸等（均為分析純） 北京鵬彩精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)器 上海標(biāo)本模型廠；HJ-3型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州振華儀器有限公司；FD5-2.5型凍干機(jī) 美國西盟生命技術(shù)有限公司；HH-S2型恒溫水浴鍋 金壇市成輝儀器廠；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計 上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；DM2000型顯微鏡及DFC280型攝像系統(tǒng) 德國徠卡公司。

1.3 卵白蛋白提取

[17]鹽析法稍作修改。分離雞蛋蛋清與蛋黃，蛋清與水按2∶1質(zhì)量比例稀釋；于25 ℃條件下邊磁力攪拌邊緩慢加入硫酸銨，加至用量為390 g/L后攪拌1.5～2.0 h，棄除白色雜質(zhì)沉淀；混合液于4 500 r/min離心20 min，上清液置于透析袋中，4 ℃透析24 h，每隔2 h更換去離子水；透析液于－55～－60 ℃真空冷凍干燥24 h，收集粉末即為卵白蛋白產(chǎn)品。

1.4 酶法改性流程

卵白蛋白→蒸餾水稀釋→調(diào)pH值至9.0→加入堿性蛋白酶→45 ℃恒溫酶解→80 ℃滅酶10 min→起泡性測定→真空冷凍干燥→改性卵白蛋白

1.5 起泡性測定[2]

稀釋改性后卵白蛋白溶液至1.0 g/100 mL，室溫下于高速分散均質(zhì)器中均質(zhì)2 min（10 000 r/min），然后快速移至250 mL量筒，記下均質(zhì)停止時泡沫體積，則起泡性按公式（1）計算。

均質(zhì)停止30 mim后，記下此時泡沫體積，則30 mim的泡沫穩(wěn)定性按公式（2）計算。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%、酶用量60 000 U/g的條件下，酶解時間設(shè)置為10、20、30、40、50、60、70 min，考察不同酶解時間對起泡性的影響；在酶解時間30 min、酶用量60 000 U/g的條件下，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%，考察不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對起泡性的影響；在酶解時間30 min、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的條件下，酶用量設(shè)置為20 000、60 000、100 000、140 000、180 000、220 000、260 000 U/g，考察不同酶用量對起泡性的影響。

1.7 泡沫微觀結(jié)構(gòu)觀察

將泡沫樣品平鋪在表面皿上形成薄薄一層，在顯微成像系統(tǒng)下放大100 倍后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時間對卵白蛋白起泡性的影響

圖1 酶解時間對卵白蛋白起泡性的影響Fig.1 Effect of enzymatic treatment time on foaming property of ovalbumin

由圖1可知，當(dāng)酶解時間為30 min時，卵白蛋白起泡性達(dá)到最佳；此后酶解時間繼續(xù)延長，起泡性逐漸下降。當(dāng)酶解時間為20 min時，卵白蛋白泡沫穩(wěn)定性最佳；此后隨酶解時間延長而逐漸下降。這可能是因?yàn)槊附獬跗凇狽H2、—COOH之間形成的氫鍵數(shù)量增多，薄膜具有足夠的黏度和機(jī)械強(qiáng)度在蛋白質(zhì)分子中形成，使得卵白蛋白的起泡性增加；之后—NH2、—COOH的數(shù)目隨著酶解過程的進(jìn)行而不斷增加，電荷數(shù)目也隨之增加，到一定程度后由于氣液薄膜強(qiáng)度降低而導(dǎo)致泡沫易破裂，起泡性也隨之降低[12,16]。當(dāng)酶解時間為30 min時卵白蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性均為較佳狀態(tài)，故酶解時間以30 min為宜。

2.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對卵白蛋白起泡性的影響

圖2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對卵白蛋白起泡性的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on foaming properties of ovalbumin

由圖2可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，卵白蛋白起泡性呈先上升而后下降的趨勢；但泡沫穩(wěn)定性一直隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而持續(xù)上升。這可能是因?yàn)樵诓粩嗍軣岬那闆r下，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大時可溶性聚合多肽由小分子進(jìn)一步聚合而成，使得界面張力增加，起泡性隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的持續(xù)增加而減小[13-14]。綜合考慮起泡性與泡沫穩(wěn)定性，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)以2.0%為宜。

2.3 酶用量對卵白蛋白起泡性的影響

由圖3可知，隨著堿性蛋白酶用量的增加，在一定范圍內(nèi)卵白蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性均隨酶用量的增加而上升，但達(dá)一定極限值后均呈下降趨勢。這可能是由于有限酶解使得蛋白質(zhì)分子柔性增加，疏水基團(tuán)充分暴露，因而使蛋白質(zhì)分子能迅速吸附至氣水界面，并隨即將界面張力下降至低水平，提升了起泡性；然而由于在界面低分子質(zhì)量肽不能形成具有黏附性質(zhì)的膜，從而導(dǎo)致起泡能力因過度水解而降低[15-16]。綜合考慮起泡性及泡沫穩(wěn)定性與生產(chǎn)成本，酶用量以140 000 U/g為宜。

圖3 酶用量對卵白蛋白起泡性的影響Fig.3 Effect of alkaline proteinase concentration on foaming properties of ovalbumin

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各因素的取值水平范圍，采用SAS RSREG程序，結(jié)合Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，選取酶解時間、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量為自變量，以卵白蛋白起泡性為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，設(shè)計方案及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table1 Experimental design and results for response surface optimization

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

表1中試驗(yàn)13、14、15為中心試驗(yàn)，其他為析因試驗(yàn)。15 個試驗(yàn)點(diǎn)分為零點(diǎn)和析因點(diǎn)，這其中零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3 次，用于估計試驗(yàn)誤差，析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所組成的三維頂點(diǎn)。采用SAS RSREG程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（one-way variance，ANOVA）分析，分析結(jié)果如表2所示。

3 個因子經(jīng)擬合后獲得的回歸模型方程為：Y= 203+8.125X1－1.125X2+1.75X3－0.75X1X2－2.5X1X3+ 1.5XX－10.875－6.375X－3.125。

表2 回歸方程各項方差分析Table2 Analysis of variance for the regression equation

由表2可知，優(yōu)化響應(yīng)面模型極顯著（P=0.001 1＜0.01），失擬項不顯著，變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.979 2）；模型調(diào)整相關(guān)系數(shù)=0.941 7，說明方法可靠，使用該方程模擬與實(shí)際擬合程度理想。由表2中Prob＞F項可知，方程中X、、1、和X1X2對Y值影響非常顯著，說明酶解時間和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對起泡性有極顯著影響；較好地反映了卵白蛋白起泡性與酶解時間、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測卵白蛋白起泡性隨各參數(shù)的變化規(guī)律[18-19]。

由SAS RSREG分析得到最大響應(yīng)值（Y）時，其最大起泡性的最佳工藝條件為：酶解時間33.6 min、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.90%、酶用量144 000 U/g，理論最大起泡性為205.0%。

2.4.3 響應(yīng)面分析

圖4 酶解時間和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互作用對起泡性影響的響應(yīng)面（a）和等高線圖（b）Fig.4 Response surface (a) and contour plots (b) for the interactive effects of enzymatic modification conditions on the foaming capability

酶解時間（X1）、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）交互作用的響應(yīng)面及等高線圖，如圖4所示，直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)曲面的陡峭可以反映該因素對響應(yīng)值影響的大小，曲面越陡，影響越大；反之，影響就小。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[20-21]。圖4表明，隨著酶解時間的延長和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，卵白蛋白起泡性先增大后減小，酶解時間的曲面比底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的曲面陡，故底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對響應(yīng)值的影響小于酶解時間，再次驗(yàn)證了單因素影響的主次順序。

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳工藝條件進(jìn)行卵白蛋白起泡性改善的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)方便，將最佳工藝調(diào)整為：酶解時間34 min、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.90%、堿性蛋白酶用量144 000 U/g，得到實(shí)際起泡性為202.0%，與理論值相差不大。因此，響應(yīng)面法對卵白蛋白酶法改性工藝條件的優(yōu)化是可行的，得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價值。

2.5 卵白蛋白泡沫微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖5 酶法改性前（a）后（b）卵白蛋白泡沫顯微圖像（×100）Fig.5 Microscopic images of foams before (a) and after (b) modification (× 100)

泡沫微觀結(jié)構(gòu)主要從色澤、大小、形狀、強(qiáng)度厚薄等方面觀察[22-23]。由圖5可知，未改性卵白蛋白泡沫色澤較暗淡、體積較大、呈橢球形、強(qiáng)度厚度較差、泡沫較為分散；而酶法改性卵白蛋白泡沫色澤較明亮、體積較小、呈正球形、強(qiáng)度厚度較好，由此可推斷酶法改性能有效改善卵白蛋白起泡性。

3 結(jié) 論

采用物理、化學(xué)或生物方法對卵白蛋白進(jìn)行改性處理以改善其功能特性具有重要的應(yīng)用意義。采用堿性蛋白酶改性卵白蛋白以提高其起泡性，單因素試驗(yàn)考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量和酶解時間對起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響，并進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化改性條件。獲得最佳改性條件為：酶用量144 000 U/g、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.90%、酶解時間34 min，在此條件下酶法改性后卵白蛋白起泡性達(dá)202.0%，為未改性（120.0%）的1.683 倍。本實(shí)驗(yàn)表明堿性蛋白酶酶法改性處理卵白蛋白能有效改善其起泡性，且酶法改性條件溫和，無化學(xué)方法導(dǎo)致的環(huán)境污染，為工業(yè)化改性生產(chǎn)專用高起泡性卵白蛋白粉的可行途徑。

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Enhancing Foaming Properties of Ovalbumin by Enzymatic Modification

HUANG Qun1, YANG Wan-gen1, JIN Yong-guo2, CHEN Hong-jie2, ZHAO Hui-yun1
(1. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The foaming properties of ovalbumin were enhanced by enzymatic modif cation with alkaline proteinase. The effects of some reaction conditions such as enzymatic treatment time, substrate concentration and alkaline proteinase concentration on foaming capability and foaming stability of ovalbumin were investigated. Based on single factor experiments, the enzymatic modif cation conditions were optimized with Box-Behnken experimental design and response surface methodology. The results revealed that the optimal modif cation conditions were determined as follows: alkaline proteinase concentration 144 000 U/g, substrate concentration 1.90%, and enzymatic treatment time 34 min. Under these conditions, the foaming capability of ovalbumin modif ed with alkaline proteinase could reach up to 202.0%, which was 1.683 times as higher as that observed for unmodif ed ovalbumin.

ovalbumin; alkaline proteinase; enzymatic modif cation; foaming properties

TS253.4

A

1002-6630（2014）23-0171-05

10.7506/spkx1002-6630-201423034

2014-06-26

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303084）

黃群（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榈捌房茖W(xué)與食品生物技術(shù)。E-mail：huangqunlaoshi@126.com